Pー糖蛋白質の構造と機能の研究

P-糖蛋白结构与功能的研究

基本信息

批准号：
02807028
负责人：
秋山伸一
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kagoshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02807028/
关键词：
Pー糖蛋白質多剤耐性薬剤結合部位副腎

项目摘要

1.ウシ副腎のPー糖蛋白質の機能の解析ウシ副腎のPー糖蛋白質の薬剤結合部位について解析するため、ウシ副腎から膜画分を分離し、[ ^3H]アジドピンでフォトアフィニティ-ラベルを行った。130KDaの分子がフォトラベルされ、この分子はPー糖給白質にする単クロ-ン抗体、Cー219で免疫沈降した。このことはウシ副腎のPー糖蛋白質が、アジドピンとの結合部位を有し、その分子量はヒト癌KB細胞のPー糖蛋白質より10KDa以上小さいことを示している。[ ^3H]アジドピンによるフォトラベルは、抗癌剤ビンブラスチンや耐性克服薬剤、レセルピン、ベラパミ-ルで阻害された。ウシ副腎Pー糖蛋白質は、ヒト癌KB細胞のPー糖蛋白質の薬剤結合部位とよく似た薬剤結合部位を持つことが判明した。2.ウシ副腎中より、Pー糖蛋白質の輸送基質となる物質の抽出について。ウシ副腎をホモジェナイズし、100%メタノ-ルで抽出した。これをヘキサンで分配し、ヘキサン層を除去したあと、酢酸エチルで分配し酢酸エチル層を濃縮乾固した。クロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムに注入して1%酢酸、2%メタノ-ル、97%クロロホルムで溶出し、多剤耐性細胞への抗癌剤の蓄積を高める活性を各画分で測定した。活性部分を薄層クロマトグラフィ-で展開し、活性部分を採取して、順相HPLC、逆相HPLCにて精製を試みた。最後のODSー2カラムで、16分附近に活性のあるピ-クが認められたので、この物質の精製を進め、構造決定を行う予定である。

1. 牛肾上腺中P-糖蛋白的功能分析为了分析牛肾上腺中P-糖蛋白的药物结合位点，从牛肾上腺中分离出膜组分并用[^3H]叠氮平进行光亲和标记去了。对 130KDa 分子进行光标记，并用 C-219（一种针对白质 P-葡萄糖的单克隆抗体）对该分子进行免疫沉淀。这表明牛肾上腺P-糖蛋白具有叠氮平结合位点，其分子量比人癌症KB细胞P-糖蛋白小10KDa以上。 [^3H]叠氮平诱导的光标记被抗癌药物长春花碱和抗耐药药物利血平和维拉帕米抑制。牛肾上腺P-糖蛋白被发现具有与人类癌症KB细胞中P-糖蛋白的药物结合位点非常相似的药物结合位点。 2.关于从牛肾上腺中提取作为P-糖蛋白转运底物的物质。将牛肾上腺匀浆并用 100% 甲醇提取。用己烷分配，除去己烷层后，用乙酸乙酯分配，将乙酸乙酯层浓缩干固。将其溶解于氯仿中，注入硅胶柱，用1%乙酸、2%甲醇、97%氯仿洗脱，测定各级分增加多重耐药细胞中抗癌药物蓄积的活性。使用薄层色谱法展开活性部分，并使用正相HPLC和反相HPLC收集并纯化活性部分。在最终的 ODS-2 柱中，在 16 分钟左右观察到活性峰，因此我们计划继续纯化该物质并确定其结构。