パッチクランプ法を用いた味覚のトランスダクション機構の解析

膜片钳法分析味觉传导机制

基本信息

批准号：
01571012
负责人：
杉本久美子
金额：
--
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

実験にはウシガエルを用い、脊髄と脳を破壊した後、舌を切ってディッシュ内に固定した。舌から茸状乳頭を切り取り、2mMEGTA液中で10〜15分間、さらに1mg/mlのコラゲナ-ゼとディスパ-ゼの酵素液中で20〜30分間インキュベ-トした後、ピペッテイングにより乳頭内の細胞を単離した。基底側細胞突起と受容膜部を含む細長い先端樹状突起とを持つ細胞を味覚受容細胞と同定した。パッチ電極を単離味細胞にあてて数ギガΩの高低抗接着を得た後、ピペット内に陰圧を加えて細胞膜を破り、whole cell記録を行った。単離味細胞から記録された静止膜電位は-70mV前後で、細胞が損傷されていないことが示された。細胞内を-70mVから脱分極させると-30mVで一過性の内向き電流を生じ、この電流は+10mVで最大となりピ-ク潜時は約6.5mSであった。-10mVから内向き電流に続く遅延外向き電流が発生し、脱分極とともにその振幅は増大した。活性化や時間経過の特徴から、一過性内向き電流は電位依存性Na^+電流であり、遅延外向き電流はK^+電流であると推察された。カエルで記録されたこれらの電位依存性イオン電流は、サンショウウオの単離味細胞から記録されたものと基本的には同様であるが、内向き電流が数nAと大きく、外向き電流が非常に小さいという特徴があった。記録中には先端樹状突起がはがれた場合には、内向き電流が消失し外向き電流のみが残ることから、Na^+チャネルは主として先端樹状突起部に存在すると考えられる。またwhole cell記録を行った後、細胞からピペットを引き離してアウトサイド・アウトパッチを得て単一チャネルの活動を検索した結果、側底膜のパッチから外向きの単一チャネル電流が記録され、電位依存性K^+チャネルが側底部に存在することが判明した。

他们在实验中使用了牛蛙，在破坏它们的脊髓和大脑后，割下它们的舌头并将它们固定在盘子里。从舌头上切下菌状乳头，在2mMEGTA溶液中孵育10-15分钟，然后在1mg/ml胶原酶和分散酶溶液中孵育20-30分钟，然后通过移液除去乳头内部的细胞，分离。具有基底细胞突起和含有受体膜的细长顶端树突的细胞被鉴定为味觉受体细胞。将贴片电极应用于分离的味觉细胞并获得数千兆欧姆的高和低粘附水平后，在移液管内施加负压以破坏细胞膜并进行全细胞记录。从分离的味觉细胞记录的静息膜电位约为-70 mV，表明细胞没有受损。当细胞从-70mV去极化时，在-30mV处产生瞬态内向电流，该电流在+10mV处达到最大值，峰值潜伏期约为6.5mS。从-10 mV开始，延迟的外向电流跟随内向电流，并且其幅度随着去极化而增加。从激活和时间过程的特性可以推断，瞬态内向电流是电压相关的Na^+电流，延迟外向电流是K^+电流。在青蛙中记录的这些电压门控离子电流与从蝾螈中分离的味觉细胞记录的基本相似，但内向电流很大，为几个nA，而外向电流具有很大且很小的特点。如果在记录过程中顶端树突被剥离，则内向电流消失，仅存在向外电流，这表明Na^+通道主要存在于顶端树突中。此外，在进行全细胞记录后，我们从细胞中取出移液器以获得外侧膜片并搜索单通道活动，结果发现从基底外侧膜膜片记录了向外的单通道电流。电压门控 K^+ 通道存在于基底外侧区域。