パッチクランプ法を用いた味覚のトランスダクション機構の解析

膜片钳法分析味觉传导机制

基本信息

批准号：
01571012
负责人：
杉本久美子
金额：
--
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

実験にはウシガエルを用い、脊髄と脳を破壊した後、舌を切ってディッシュ内に固定した。舌から茸状乳頭を切り取り、2mMEGTA液中で10〜15分間、さらに1mg/mlのコラゲナ-ゼとディスパ-ゼの酵素液中で20〜30分間インキュベ-トした後、ピペッテイングにより乳頭内の細胞を単離した。基底側細胞突起と受容膜部を含む細長い先端樹状突起とを持つ細胞を味覚受容細胞と同定した。パッチ電極を単離味細胞にあてて数ギガΩの高低抗接着を得た後、ピペット内に陰圧を加えて細胞膜を破り、whole cell記録を行った。単離味細胞から記録された静止膜電位は-70mV前後で、細胞が損傷されていないことが示された。細胞内を-70mVから脱分極させると-30mVで一過性の内向き電流を生じ、この電流は+10mVで最大となりピ-ク潜時は約6.5mSであった。-10mVから内向き電流に続く遅延外向き電流が発生し、脱分極とともにその振幅は増大した。活性化や時間経過の特徴から、一過性内向き電流は電位依存性Na^+電流であり、遅延外向き電流はK^+電流であると推察された。カエルで記録されたこれらの電位依存性イオン電流は、サンショウウオの単離味細胞から記録されたものと基本的には同様であるが、内向き電流が数nAと大きく、外向き電流が非常に小さいという特徴があった。記録中には先端樹状突起がはがれた場合には、内向き電流が消失し外向き電流のみが残ることから、Na^+チャネルは主として先端樹状突起部に存在すると考えられる。またwhole cell記録を行った後、細胞からピペットを引き離してアウトサイド・アウトパッチを得て単一チャネルの活動を検索した結果、側底膜のパッチから外向きの単一チャネル電流が記録され、電位依存性K^+チャネルが側底部に存在することが判明した。

在实验中，使用牛蛙来消灭脊髓和大脑，然后切开舌头并将其固定在菜肴中。从舌头切出真菌乳头，并在2 mmegta溶液中孵育10-15分钟，并在1 mg/ml胶原酶中孵育20-30分钟，然后移液溶液，然后移液以分离乳头内的细胞。具有基底细胞突起和含有受体膜的顶端树突的细胞被鉴定为味觉受体细胞。将斑块电极应用于孤立的味觉细胞以获得数个千兆hm的高和低抗激活后，将负压施加到移液器上以破坏细胞膜，并进行全细胞记录。从分离的味觉细胞中记录的静息膜电位约为-70 mV，表明细胞未损坏。在-70 mV中在细胞内去极化可在-30 mV处产生瞬态内向电流，最大值为+10 mV，峰潜伏期约为6.5 ms。从-10 mV产生延迟的向外电流，然后是向内电流，其幅度随着去极化而增加。基于激活和时间过程的特征，估计向内的瞬态电流是电压依赖性的Na^+电流，并且向外电流延迟是k^+电流。这些在青蛙中记录的电压依赖性离子电流基本上与从sal的孤立味道细胞中记录下来的电压相同，但其特征是几个Na的大内向电流和非常小的外向电流。在记录过程中，如果顶端树突被剥离，向内电流消失，并且只有向外的电流，则认为Na^+通道主要存在于根尖树突中。全细胞记录后，将移液器从细胞中分离出来，以获取外部外部贴片以搜索单个通道活动，并从基底外侧膜的贴片中记录了外部通道电流，表明基底外侧部分存在电压依赖性K^+通道。