肺病変修復過程の解明-生体内培養による肺胞上皮細胞増殖因子、水腫液吸収因子の検索

阐明肺部病变修复过程——体内培养寻找肺泡上皮细胞生长因子和水肿液吸收因子

基本信息

批准号：
01570867
负责人：
須加原一博
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ヒト肺胞II型上皮細胞の分離培養と機能;肺癌などで肺切除を受けた患者の切除肺からヒト肺胞II型上皮細胞を分離培養し、その機能を検索した。症例11名中肺胞II型上皮細胞のpurityが50%以上であった8例では、切除肺1g当り2.7×10^6個のII型細胞が得られ、タンニン酸固定によるpurityは71.0±3.4%であった。ラット肺のII型細胞と比較し、顆粒の小さい層状封入体を多数含んでいた。蛍光抗体法によるアクチンフィラメントなどの構造にも両者で差がみられた。肺表面活性物質のアポ蛋白分泌を測定すると、6時間で10^6個あたり35ngが分泌され、ADP(10^<-3>M)で約2倍に増加し、機能的にはあまり両者に差がみられなかった。2.生体内培養;分離肺胞上皮細胞をフィルタ-を付着した拡散chamber内に培養し、再度ラットの腹腔内にいれ数日培養すると、細胞増殖がin vitroより強くみられる。現在、肺表面活性物質のcDNAを用いてその細胞内合成をin situ hybridization法で調べている。肺表面活性物質の産生、各種刺激物質に対するH^3-thymidinの取り込みやイオントランスポ-トなどについてin vitroの培養細胞と比較しているが、時に炎症細胞の混入があるのでin situ hybridization法で確実に証明しようとしている。In situ hybridization法による肺表面活性物質アポ蛋白のcDNAを用いた細胞内合成については糖尿病ラット、高酵素濃度投与ラットやシリカ投与ラットなど肺表面活性物質合成の促進・抑制状態でも研究を進めている。さらに、胎児肺での合成過程についても研究を進めている。3.肺胞上皮細胞透過性に対する喫煙の影響;たばこの煙や各種炎症細胞の肺胞上皮細胞透過性への影響を調べた。Tobacco smokeで細胞活性を示す短絡電流(SCC)が90分後に60%に低下し、バッファ-液に肺胞マクロファ-ジを加えtobacco smokeの影響をみると、SCCがさらに低下した。Tabacco smoke自体による肺胞上皮細胞障害だけでなく、肺胞マクロファ-ジを刺激することで障害が増強することを示している。Tobacco smokeの成分では、ニコチン自体の影響をみると、1μMではあまり変化しないが、10μMでSCCが逆に促進された。アクロレインでは、10^<-3>Mで強い障害がみられ、二酸化窒素20PPMでもSCCの低下がみられた。現在、肺表面活性物質のcDNAを用いて細胞内での合成能について検索しているが、胎児肺での合成過程の解明などを含め肺表面活性物質の産生・分泌の調節が明らかになるだろう。今後肺癌発生機序を含めた癌遺伝子についても研究を進めたい。

1.人肺泡II型上皮细胞的分离培养；从肺癌等接受肺切除术的患者的切除肺中分离培养人肺泡II型上皮细胞，并研究其功能。肺泡II型上皮细胞纯度为50%以上的11例中，有8例每1g切除肺获得2.7×10^6个II型细胞，单宁酸固定纯度为71.0±3.4 %。与大鼠II型肺细胞相比，它们含有许多小颗粒的层状包涵体。使用荧光抗体方法还观察到两者之间肌动蛋白丝等结构的差异。测量肺表面活性物质脱辅基蛋白的分泌量显示，6小时内每10^6蛋白分泌35ng，使用ADP（10^-3>M）增加约两倍，功能上几乎没有差异两者之间没有观察到差异。 2.体内培养：将分离的肺泡上皮细胞在附有过滤器的扩散室中培养，然后放回大鼠腹腔中培养数天，观察到比体外更强烈的细胞增殖。目前，我们正在利用cDNA原位杂交研究肺表面活性剂的细胞内合成。我们正在与体外培养的细胞比较肺表面活性物质的产生、对各种刺激物的H^3-胸苷摄取、离子转运等，但由于炎症细胞有时被污染，因此不建议进行原位杂交。我正在努力证明这一点。我们还在促进或抑制肺表面活性剂合成的条件下，例如糖尿病大鼠、给予高浓度酶的大鼠和给予二氧化硅的大鼠，利用原位杂交技术进行肺表面活性剂脱辅基蛋白的细胞内合成研究。此外，我们还在对胎儿肺部的合成过程进行研究。 3、吸烟对肺泡上皮细胞通透性的影响；研究了香烟烟雾和各种炎症细胞对肺泡上皮细胞通透性的影响。由于烟草烟雾，表明细胞活性的短路电流（SCC）在 90 分钟后下降至 60%，当将肺泡巨噬细胞添加到缓冲溶液中以检查烟草烟雾的影响时，SCC 进一步下降。这说明肺泡上皮细胞损伤不仅是烟草烟雾本身造成的，而且刺激肺泡巨噬细胞也会加剧损伤。从烟草烟雾中尼古丁本身的影响来看，1 μM 并没有太大变化，但 10 μM 却促进了 SCC。对于丙烯醛，在10^-3M下观察到强烈的损伤，并且甚至在20PPM的二氧化氮下也观察到SCC的减少。目前，我们正在寻找利用cDNA在细胞内合成肺表面活性剂的能力，并且阐明肺表面活性剂的产生和分泌的调控，包括阐明胎儿肺中的合成过程。未来我想进一步研究癌症基因，包括肺癌发生的机制。