マイオサイトの収縮および自発的運動におけるホスホランバンの役割とα_1受容体の役割

受磷蛋白和α_1受体在性母细胞收缩和自发运动中的作用

基本信息

批准号：
63570061
负责人：
鈴木隆
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63570061/
关键词：
α_1受容体プラゾシン受容体結合活性

项目摘要

α_1受容体精製を行う前に膜分画を用いて受容体測定法を考察した。方法として次の順序にて行った。1)細胞膜分画の調製ブタ心臓左心室を4倍量のアンチペイン(5μg/ml)、ロイペプチン(5μg/ml)、1mMEDTAおよび0.25Mショ糖を含む20mMHEPES,pH7.4溶液でマイルドにホモジナイズし、800xg、15分間遠心した。その上清をさらに9000xgで15分間遠心し、その沈査を0.25Mショ糖で懸濁後70%ショ糖溶液で最終濃度44%にした。遠心管に懸濁液を入れ、42.5%および0.25Mショ糖溶液を重層し45K回転で40分間遠心した。42.5%ショ糖上に生じた膜画分を細胞膜画分とした。2)細胞膜を用いた受容体測定法の考察α_1受容体のアンタゴニスト(放射性^BH)プラゾシンを用いて、結合活性をニトロセルロース膜を用いたロ過法により測定した。総結合量合活性は1〜10μM放射性プラゾシン結合量とし、非特異的結合量は20μM非放射性プラゾシン存在下1〜10μM放射性プラゾシンの結合量とした。真の結合量は総結合から非特異的結合量を引いたものとした。真の結合量は、タンパク量およびプラゾシン量に応じて直線性を示した。3)可溶化膜成分中の受容体測定法の考察膜を0.5%CHAPSで可溶化後、45K回転で40分間遠心し、上清を受容体結合測定に用いた。5%ポリエチレンイミド、pH10の溶液で処理したグラスファイバーフィルターを用いて、ロ過法にて放射性プラゾシン結合量を測定した。真の結合量は放射性プラゾシン量の上昇と共に、およびタンパク量と共に直線的に上昇した。以上の結果は、α_1受容体の分離精製の基礎を築くものである。

在α_1受体纯化之前，使用膜分数讨论了受体测定。 The method was carried out in the following order: 1) Preparation of plasma membrane fraction The left ventricle of the pig heart was mildly homogenized with a 20 mM HEPES, pH 7.4 solution containing 4 times the volume of antipain (5 μg/ml), leupeptin (5 μg/ml), 1 mM EDTA and 0.25 M sucrose and centrifuged at 800 xg for 15 minutes.将上清液以9000xg离心15分钟，并用0.25m的蔗糖悬浮沉淀，然后以70％的蔗糖溶液终止浓度为44％。将悬浮液放置在离心管中，分层为42.5％和0.25m蔗糖溶液，并在45K旋转下离心40分钟。在42.5％蔗糖上形成的膜馏分用作细胞膜分数。 2）使用细胞膜考虑受体测定，通过使用α_1受体的拮抗剂（放射性^BH）帕唑嗪来测量结合活性。总结合活性为1-10μM放射性杂质素结合量，在存在20μM非放射性prazosin的情况下，非特异性结合量为1-10μM放射性杂质蛋白结合量。结合的真实量是结合的总量减去非特异性结合的量。根据蛋白质和prazosin量，真正的结合量是线性的。 3）在溶解的膜成分中考虑受体测定法用0.5％的CHAP溶解膜，然后在45K旋转下离心40分钟，并将上清液用于受体结合测量。使用用5％聚乙烯酰亚胺的溶液处理的玻璃纤维滤镜，通过Roth方法测量放射性肾上腺素的结合量，pH 10。真正的结合量随着放射性prazosin量的增加而呈线性增加，并与蛋白质的量增加。以上结果为α_1受体的分离和纯化提供了基础。