マイオサイトの収縮および自発的運動におけるホスホランバンの役割とα_1受容体の役割

受磷蛋白和α_1受体在性母细胞收缩和自发运动中的作用

基本信息

批准号：
63570061
负责人：
鈴木隆
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63570061/
关键词：
α_1受容体プラゾシン受容体結合活性

项目摘要

α_1受容体精製を行う前に膜分画を用いて受容体測定法を考察した。方法として次の順序にて行った。1)細胞膜分画の調製ブタ心臓左心室を4倍量のアンチペイン(5μg/ml)、ロイペプチン(5μg/ml)、1mMEDTAおよび0.25Mショ糖を含む20mMHEPES,pH7.4溶液でマイルドにホモジナイズし、800xg、15分間遠心した。その上清をさらに9000xgで15分間遠心し、その沈査を0.25Mショ糖で懸濁後70%ショ糖溶液で最終濃度44%にした。遠心管に懸濁液を入れ、42.5%および0.25Mショ糖溶液を重層し45K回転で40分間遠心した。42.5%ショ糖上に生じた膜画分を細胞膜画分とした。2)細胞膜を用いた受容体測定法の考察α_1受容体のアンタゴニスト(放射性^BH)プラゾシンを用いて、結合活性をニトロセルロース膜を用いたロ過法により測定した。総結合量合活性は1〜10μM放射性プラゾシン結合量とし、非特異的結合量は20μM非放射性プラゾシン存在下1〜10μM放射性プラゾシンの結合量とした。真の結合量は総結合から非特異的結合量を引いたものとした。真の結合量は、タンパク量およびプラゾシン量に応じて直線性を示した。3)可溶化膜成分中の受容体測定法の考察膜を0.5%CHAPSで可溶化後、45K回転で40分間遠心し、上清を受容体結合測定に用いた。5%ポリエチレンイミド、pH10の溶液で処理したグラスファイバーフィルターを用いて、ロ過法にて放射性プラゾシン結合量を測定した。真の結合量は放射性プラゾシン量の上昇と共に、およびタンパク量と共に直線的に上昇した。以上の結果は、α_1受容体の分離精製の基礎を築くものである。

在纯化α_1受体之前，我们考虑了使用膜分级的受体测量方法。方法如下： 1) 细胞膜组分的制备将猪心脏的左心室用含有4倍量的抗痛剂(5μg/ml)、亮肽素(5μg/ml)、1mMEDTA和0.25M蔗糖的20mM HEPES、pH 7.4溶液轻轻匀浆，并以 800xg 离心 15 分钟。将上清液进一步以9000×g离心15分钟，将沉淀悬浮于0.25M蔗糖中，然后用70％蔗糖溶液配制成终浓度为44％。将悬浮液置于离心管中，分层加入42.5%和0.25M蔗糖溶液，并在45K下离心40分钟。在 42.5% 蔗糖上产生的膜级分被指定为细胞膜级分。 2)考虑使用细胞膜的受体测量方法使用α_1受体拮抗剂(放射性^BH)哌唑嗪，通过使用硝酸纤维素膜的过滤法测量结合活性。总结合活性为1至10μM放射性哌唑嗪，非特异性结合为在20μM非放射性哌唑嗪存在下结合1至10μM放射性哌唑嗪。通过从总结合中减去非特异性结合的量来确定真实的结合量。真实的结合量显示出线性，具体取决于蛋白质和哌唑嗪的量。 3)溶解膜成分中受体测定方法的研究用0.5％CHAPS溶解膜后，以45K旋转离心40分钟，将上清液用于受体结合测定。结合的放射性哌唑嗪的量通过使用用5%聚乙烯酰亚胺溶液（pH 10）处理的玻璃纤维过滤器的过滤方法来测量。真实结合量随着放射性哌唑嗪量的增加和蛋白质量的增加而线性增加。上述结果为α_1受体的分离纯化奠定了基础。