マウスMHC領域内高頻度遺伝子組み換え機構の分子遺伝学的解析

小鼠MHC区域高频基因重组机制的分子遗传学分析

基本信息

批准号：
60570232
负责人：
城石俊彦
金额：
$ 0.45万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1987
资助国家：
日本
起止时间：
1987 至 1988
项目状态：
已结题

项目摘要

日本産野性マウス由来のH-2遺伝領域を持つBIO.MOL-SGRコンジェニック系統は近交系マウスと交配した場合, マウス主要組織適合複合体であるH-2内のK-AB遺伝子間において従来得られているものより約100倍高い頻度で遺伝的組み換えを示す. 今年度は, 組み換えがK-A_B遺伝子間のどこで生じているかを明らかにするため前年度に引き続きBIO.MOL-SGR系統から独立に得られてきた15系統の組み換え体を用いて, 組み換えの切断点をDNAレベルで詳細にマップすることを試みた. このためにK-A_B遺伝子間を完全にカバーするコスミッドクローンからこの領域の様々な部位に対応する数多くのDNAプローブを作製した. これらのプローブを用いて, 組み換え体を得るために交配した親系統間でみられる制限酵素DNA断片の多型を基に各々のプローブが対応している部位がどちらの親由来であるかを確認した. この結果, 全ての組み換えが, 約20KbpのDNA断片内に限局していることが明らかとなった. さらに, この部位に対応する三種類の異なるDNAプローブを調整して分析したところ9つの組み換え系統では, 切断点が僅か1Kbpの極めて狭い領域に集中していることがわかった. 従って, この遺伝領域には遺伝的組み換えのHot-spotが存在することが明らかとなった. そこで, この遺伝領域をさらに詳細に分子レベルで解析する目的でHot-spot及びその近傍をコスミッドをベクターとしてクローニングすることを試みた. これまでのところ, 組み換え実験に用いた親系統であるBIO.MOL-SGR,BIO.A,BIOの三系統から各々, ゲノミックDNAライブラリーを作製し, 目的とするHot-spot及びそれに対応するDNA部位を含む40Kbp程の長さを持ったDNA断片をクローニングした. 現在, それらの塩基配列の決定と一次構造の比較を進めている.

当来自日本野生小鼠的具有 H-2 遗传区域的 BIO.MOL-SGR 同源品系与近交小鼠杂交时，H-2 内的 K-AB 基因（小鼠主要组织相容性复合体）显示出以一定频率发生基因重组的情况。比之前观察到的大约高 100 倍。为了弄清楚K-A_B基因之间发生重组的位置，我们使用了前一年从BIO.MOL-SGR系独立获得的15个重组体来确定DNA水平上的重组断点。来自完全覆盖 K-A_B 基因间隙的粘粒克隆中对应于该区域中各个位点的 DNA 探针数量。使用这些探针，我们，根据在杂交获得重组体的亲本系之间观察到的限制性内切酶DNA片段的多态性，我们确认了每个探针对应的位点源自哪个亲本，表明重组位于约20Kbp的DNA片段内。此外，当制备和分析对应于该位点的三种不同类型的DNA探针时，在九个重组系中，结果发现断点集中在一个仅1Kbp的极其狭窄的区域，因此明确了该基因区域存在基因重组热点。为了在分子水平上进行详细分析，我们尝试进行克隆。到目前为止，使用粘粒载体检测热点及其附近区域。从重组实验中使用的三个亲本系 BIO.MOL-SGR、BIO.A 和 BIO 中的每一个创建基因组 DNA 文库，并制备了包含所需热点及其相应 DNA 位点的约 40 Kbp。目前，我们正在确定其碱基序列并比较其一级结构。