ブリルアン・ラマン同時イメージングによる細胞内局所環境のラベルフリー定量の実現

通过同时布里渊-拉曼成像实现细胞内局部环境的无标记定量

• 批准号: 22KJ0289
• 负责人: 柴田 大輝
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0289/
• 关键词: 液-液相分離; ラマン散乱; ブリルアン散乱

本研究は細胞内の液液相分離(LLPS)の物性解明を目的とする。細胞内のLLPSとは、あるタンパク質が液滴と呼ばれる非常に高濃度の構造物を形成する現象を指し、ストレス応答や酵素反応など様々な生理現象に関与するとされる。さらに、神経変性疾患において、LLPSはタンパク質の線維凝集の前段階であると提案されている。本研究では、ラマン散乱とブリルアン散乱を組み合わせた新たなイメージングシステムを用い、液滴内の水の量、タンパク質濃度と構造、動的変化のラベルフリー定量の確立を目的とする。液滴、ゲル、線維を定量的に判別し、線維化を示す液滴の共通性質を解明する。本年度の研究では、神経変性疾患関連タンパク質として、マチャド・ジョセフ病の発症に関与するポリQタンパク質であるアタキシン3を用いて、タンパク質液滴の経時変化を観測した。タンパク質液滴は数マイクロメートル程度の大きさのため、液滴内部を詳細に解析するためには、高い空間分解能が要求される。そこで、はじめに高開口数の対物レンズを用いてゼラチンの測定を行い、ブリルアンスペクトルが過去の報告と同一の傾向を示すことを確かめ、高い空間分解能で液滴を観測できることを確認した。続いて、緩衝溶液中でタンパク質液滴を作成し、その経時変化をブリルアン・ラマンスペクトルの同時測定により追跡した。液滴のブリルアンスペクトルに波数の異なる2つのピークが観測されたことから、液滴内に液体様成分と固体様成分が共存することがわかった。時間経過に従い、固体成分に由来すると考えられるバンドの強度が増加したが、ラマンスペクトルのアミドIバンドのシフトはブリルアンスペクトルの変化に対して遅れていることを検出した。このことから、液滴の相転移が生じてから多段階でタンパク質のβシート化が進んでいることがわかった。

本研究旨在阐明细胞内液-液相分离（LLPS）的物理性质。细胞内LLPS是指某些蛋白质形成高度浓缩的结构（称为液滴）的现象，这种现象被认为与应激反应和酶反应等各种生理现象有关。此外，LLPS 被认为是神经退行性疾病中蛋白质纤维聚集的前体。在这项研究中，我们的目标是使用结合拉曼散射和布里渊散射的新成像系统，对液滴中的水量、蛋白质浓度和结构以及动态变化进行无标记定量。我们将定量区分液滴、凝胶和纤维，并阐明表现出纤维化的液滴的共同特征。在今年的研究中，我们使用ataxin-3（一种参与马查多-约瑟夫病发病的polyQ蛋白）作为神经退行性疾病相关蛋白，来观察蛋白滴随时间的变化。由于蛋白质液滴的大小约为几微米，因此需要高空间分辨率来详细分析液滴的内部。因此，我们首先使用高数值孔径物镜测量明胶，并确认布里渊光谱显示出与过去报道相同的趋势，证实可以以高空间分辨率观察液滴。接下来，在缓冲溶液中创建蛋白质液滴，并通过同时测量布里渊拉曼光谱来跟踪它们随时间的变化。在液滴的布里渊光谱中观察到两个不同波数的峰，表明液滴内存在类液体成分和类固体成分。随着时间的推移，被认为源自固体成分的谱带强度增加，但检测到拉曼光谱中酰胺I谱带的移动相对于布里渊光谱的变化被延迟。这表明，在液滴发生相变后，蛋白质β-折叠的形成分多个阶段进行。

项目成果

ブリルアン・ラマン同時イメージングによる液-液相分離によるタンパク質液滴の変化の観測

使用同时布里渊-拉曼成像观察液-液相分离引起的蛋白质液滴的变化

• 发表时间: 2022
• 作者: 柴田大輝;梶本真司;中林孝和
• 通讯作者: 中林孝和

ブリルアン・ラマン同時イメージングによる液-液相分離の定量解析

通过同时布里渊-拉曼成像定量分析液-液相分离

• 发表时间: 2022
• 作者: 柴田大輝;梶本真司;中林孝和
• 通讯作者: 中林孝和