細胞壁形成がG2/M進行をコントロールする分子機構

细胞壁形成控制G2/M进程的分子机制

基本信息

批准号：
09878158
负责人：
大矢禎一
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09878158/
关键词：
細胞壁酵母細胞周期チェックポイント

项目摘要

出芽酵母の1,3-β-グルカン合成酵素の触媒サブユニットは、FKS1、FKS2と呼ばれる相同性の高い2つの遺伝子によってコードされており、両遺伝子の破壊は致死になる。そこで、FKS1 FKS2の二重破壊株にPCRによってランダムに変異の入ったfks1を持つプラスミドを導入し、37℃で増殖できない変異株をスクリーニングする方法で、17の温度感受性変異株を単離した。これらの株についてFKS1内のユニークな制限酵素サイトを用いてサブクローニングを行った結果、10個の変異株について温度感受性に関与している領域を限定し、変異部位を決定することが出来た。これら10個の変異株についてサブクローニングした変異を染色体内に組み込み、表現型が安定な状態で解析できるようにした。得られた10個の変異株が実際にグルカン合成に欠損を持つかどうか調べるために、それぞれの変異株から膜画分を調製し、in vitroのグルカン合成酵素活性を測定した。さらに、l,3-β-グルカンを特異的に染色するアニリンブルー色素を用いてin vivoでグルカンを作ることができるかどうか調べた。その結果、fks1-1114、fks1-1125、fks1-1144、fks1-1154の4つの変異株はin vitroのグルカン合成酵素活性が顕著に低下しており、制限温度下ではin vivoでもグルカン合成に欠損が見られた。グルカン合成と細胞周期進行との関連を調べるために、これらの変異株について制限温度下での細胞と核の形態を顕微鏡で観察し、DNA含量をFACS解析で調べた。その結果、 in vitro.in vivoでグルカン合成に欠損を持つ変異株は制限温度下で芽を持たないかあるいは小さな芽の様な突起を持った細胞を多数蓄積し、核は1核のままであったが、DNAの複製は正常に終了していた。この時、細胞の生存率は比較的高く保たれていたことから、細胞が単に死に絶えているわけではなく、グルカン合成に欠損が生じた際の細胞応答の1つの現れとしてG2/M期の細胞の蓄積が見られていると考えられた。この結果は、細胞のもっとも外側で起こっている細胞壁合成と細胞周期進行が密接に関わりを持ちながら制御されていることを示唆している。

酿酒酵母 1,3-β-葡聚糖合酶的催化亚基由两个高度同源的基因 FKS1 和 FKS2 编码，这两个基因的破坏都是致命的。因此，我们通过PCR将含有随机突变fks1的质粒导入FKS1 FKS2双破坏菌株中，筛选出不能在37℃下生长的突变菌株，分离出17个温度敏感突变菌株。通过使用 FKS1 内独特的限制性酶位点对这些菌株进行亚克隆，我们能够限制与温度敏感性相关的区域，并确定 10 个突变菌株的突变位点。这10个突变株的亚克隆突变被整合到染色体中，可以在稳定状态下分析它们的表型。为了研究获得的 10 个突变菌株是否确实存在葡聚糖合成缺陷，从每个突变菌株中制备膜组分并在体外测量葡聚糖合酶活性。此外，我们研究了是否可以使用苯胺蓝染料在体内产生葡聚糖，该染料特异性地染色 l,3-β-葡聚糖。结果发现，四种突变菌株fks1-1114、fks1-1125、fks1-1144和fks1-1154在体外葡聚糖合酶活性显着降低，并且在限制性温度条件下体内葡聚糖合成存在缺陷。为了研究葡聚糖合成与细胞周期进程之间的关系，我们使用显微镜在限制温度下观察了这些突变体的细胞和核形态，并使用 FACS 分析检查了它们的 DNA 含量。结果，在体外和体内，葡聚糖合成缺陷的突变菌株在限制性温度条件下积累了许多没有芽或有小芽状突起的细胞，并且细胞数量仍然单一，但DNA复制却正常完成。此时，细胞的存活率保持相对较高，因此细胞并不是简单地死亡，而是G2/M期的细胞被认为是葡聚糖合成缺陷时细胞反应的一种表现。的这一结果表明，发生在细胞最外层的细胞壁合成和细胞周期进程密切相关并受到调节。