ビタミンDによる遺伝子発現抑制の分子機構-新しいビタミンD抑制反応DNA配列とそれに結合する転写因子群

维生素 D 抑制基因表达的分子机制——新的维生素 D 抑制反应 DNA 序列及其结合的转录因子

基本信息

批准号：
09671033
负责人：
岡崎具樹
金额：
$ 2.05万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

1)ヒトPTHrP遺伝子上の負のビタミンD反応性DNA配列(nVDRE_<hPTHrP>)を標識し、成人Tリンパ球MT2細胞核蛋白との間でゲルシフトアッセイ(EMSA)を行った。一方、(positive)VDREとしてオステオポンチン遺伝子のVDRE(VDREmop)を合成し同様のEMSAを行った。競合実験から、この2種のDNAは、異なる組み合わせの核蛋白と結合することがわかった。2)このEMSAの系にVDR及びRXRの抗体を加えた結果、VDREmopにはMT2細胞核蛋白においてVDR-RXR複合体が結合するが、nVDRE_<hPTHrP>には、VDRのみが、VDREmopとは異なる結合様式で、RXRではない他の核蛋白と結合した。3)Ku抗原に対する抗体を用いたEMSAで、このnVDRE_<hPTHrP>に対して、VDRと協調的に結合する蛋白の一つにKu抗原が含まれることがわかった。4)nVDRE_<hPTHrP>、VDREmopをそれぞれ含むレポーター遺伝子をMT2細胞に導入したところ、1,25ビタミンD_3のnVDRE_<hPTHrP>を媒介とする転写抑制現象がこのDNA配列特異的に認められた。この抑制はKu抗原のアンチセンス発現ベクターの共導入によって解消した。5)ビタミンDはDNA-MT2核蛋白複合体の結合を抑制した。この結合抑制は、酸フォスファターゼ処理で解除された。このことからビタミンDによるVDRの燐酸化がこの現象に関与する可能性が示唆された。以上から、ビタミンDは、a)nVDREと結合するVDRの立体構造を変化させ、b)さらにおそらくVDRとは別個の部位のnVDREに結合しているKu抗原がリクルートしてくるDNA-PKによってこの構造を変えたVDRを燐酸化させ、c)nVDREとVDRの結合を減弱させる結果、nVDREを介する転写抑制を惹起している可能性が示された。

1）标记了人PTHRP基因上的阴性维生素D-反应性DNA序列（NVDRE_ <HPTHRP>），并在成年T淋巴细胞MT2细胞核蛋白之间进行了凝胶化测定（EMSA）。另一方面，（阳性）VDRE与骨ponchin基因VDRE（VDREMOP）合成，并进行了相同的EMSA。竞争实验表明，这两个DNA与核蛋白的不同组合结合。 2）由于在此EMSA系统中添加VDR和RXR抗体，VDR-RXR复合物与MT2细胞蛋白中的VDREMOP结合，但NVDRE_ <HPTHRP>仅与其他vdrmop结合在一起。不是rxr。 3）EMSA使用抗Ku抗原抗体的EMSA，该抗原被发现在一种与VDR协调的NVDRE_ <HPTHRP>配位的蛋白质中包含KU抗原。 4）将含有NVDRE_ <HPTHRP>和VDREMOP的记者基因引入了MT2细胞中，并且通常观察到基于1,25个维生素D_3 NVDRE_ <HPTHRP>的转录抑制现象。通过ku抗原的抗强度的CO引入来解决这种抑制作用。 5）维生素D抑制了DNA-MT2核蛋白复合物的键。这种结合抑制是通过酸绒毛fatase处理释放的。这表明维生素D的VDR磷酸可能参与了这种现象。从上面，维生素D将VDR键的三维结构变化为A）NVDRE，而KU抗原募集的DNA-PK可能与NVDRE键合可能与VDR分开。改变结构VDR的转录，NVDRE和VDR之间的键不一致，从而通过NVDRE导致转录控制。