レポーター発現を指標とした幹細胞の単離と細胞特性の解析

以报告基因表达为指标，分离干细胞并分析细胞特征

基本信息

批准号：
08878138
负责人：
阿部訓也
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

始原生殖細胞(PGC)、神経冠細胞ともに幹細胞的性質を有し、多文化能を保持しつつ胚体内を移動し、行き着いた先の微少環境に応じて、PGCは生殖細胞に、神経冠細胞は神経組織、間葉系、内分泌組織などに分化する。これらの細胞の多文化能の維持、或いは各種の細胞への分化の機構は、未だ遺伝子レベルでは明らかではない。これはこの種の幹細胞は胚発生時に少数しか存在せず、単離も困難なため、直接そこに発現する遺伝子群を解析する段階まで至っていないことに起因すると思われる.そこで何らかの方法でこれらの細胞をマークし、単離した後、様々な角度から解析を行うことが重要と考えられる。そこで本研究では、まずマウスPGCを純化・単離する技術を確立することを目標とし実験を行った。具体的にはPGCのマーカーであるアルカリフォスファターゼ遺伝子をlacZ(大腸菌β-ガラクトシダーゼ)遺伝子で置換したTNAP(組織非特異型アルカリフォスファターゼ)ノックアウトマウスを用い、lacZ発現を指標としてPGCを分離、純化する方法を開発した.すなわち、PGCを含む胚体組織を解離し、細胞懸濁液を得、これにβ-ガラクトシダーゼの蛍光基質であるFDGを細胞内を取り込ませ、セルソーターを用いてlacZ陽性細胞を検出、単離するというものである.lacZ陽性を示す細胞がPGCであることを確かめるため、単離した蛍光陽性の細胞に対していくつかのPGCマーカーによる染色を行った。まずアルカリフォスファターゼ染色をのすると蛍光陽性細胞の95^〜98%が染色されることが判明した。染色される細胞は、典型的な始原生殖細胞の形態を持つことが確かめられた。また、PGCの増殖に必須なチロシンキナーゼであるc-Kitの抗体で染めたところ、やはり^〜98%の細胞が染色された。これらの結果より、今回用いた手法により、PGCを従来の方法では得ることできなかった非常に高い純度で単離することができることが明らかになった。また、神経冠細胞においてレポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを樹立し、このマウスでは移動期以降の神経冠細胞、或いはそれに由来する組織を特異的にマークすることができることを示した.この系統を利用し、神経冠細胞の細胞系譜解析や上記の技術を利用しての神経冠細胞の単離実験を行っている.

全球细胞（PGC）和神经冠状细胞具有干细胞的特性，在保持多种文化能力的同时移动到胚胎中，并且根据它们到达的小环境，PGC是一种生殖细胞，神经冠细胞神经组织，Gerby，内分泌组织等在遗传水平上，仍无法清楚地维持这些细胞维持多种文化能力或分化为各种细胞的机制。这可能是由于这种类型的干细胞仅在胚胎的情况下存在，因此很难进行，因此它没有达到直接表达的基因的阶段。标记细胞并分离后的角度。因此，在这项研究中，我们首先进行了一个实验，其目的是建立一种纯化和隔离小鼠PGC的技术。具体而言，PGC标记碱性POSFATASE基因基因被LACZ（大肠杆菌β-Galacto Shidase）基因（组织非特异性碱性碱性碱性蛋白酶）敲除小鼠，以将PGC分离为指示。含有PGC的组织，获得的细胞悬浮液，FDG是β-Galact苹果酒的荧光底物，用于检测使用Calluster的LACZ阳性细胞。 PGC，一些PGC标记被几个PGC标记染色。首先，事实证明，当碱性fatase染色时，95^98％的荧光细胞染色。已经证实，染色的细胞具有典型的原始生殖细胞形式。同样，当用c-kit的抗体染色（这是酪蛋白酶，对于PGC的生长至关重要）时，将染色的细胞染色。这些结果表明，这次使用的方法可以在很高的纯度上隔离，而常规方法无法获得。此外，已经建立了一种在神经冠中表达报告基因的转基因小鼠，表明该小鼠可以在运动期或从中衍生的组织后特异性地标记神经元的神经细胞。并使用上述技术提供神经皇冠细胞实验。