レポーター発現を指標とした幹細胞の単離と細胞特性の解析

以报告基因表达为指标，分离干细胞并分析细胞特征

• 批准号: 08878138
• 负责人: 阿部 訓也
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08878138/
• 关键词: 始原生殖細胞; 神経冠細胞; 幹細胞; 多文化能; トランスジェニックマウス; 遺伝子発現; 始原生殖細胞; 神経冠細胞; 幹細胞; 多文化能; トランスジェニックマウス; 遺伝子発現

始原生殖細胞(PGC)、神経冠細胞ともに幹細胞的性質を有し、多文化能を保持しつつ胚体内を移動し、行き着いた先の微少環境に応じて、PGCは生殖細胞に、神経冠細胞は神経組織、間葉系、内分泌組織などに分化する。これらの細胞の多文化能の維持、或いは各種の細胞への分化の機構は、未だ遺伝子レベルでは明らかではない。これはこの種の幹細胞は胚発生時に少数しか存在せず、単離も困難なため、直接そこに発現する遺伝子群を解析する段階まで至っていないことに起因すると思われる.そこで何らかの方法でこれらの細胞をマークし、単離した後、様々な角度から解析を行うことが重要と考えられる。そこで本研究では、まずマウスPGCを純化・単離する技術を確立することを目標とし実験を行った。具体的にはPGCのマーカーであるアルカリフォスファターゼ遺伝子をlacZ(大腸菌β-ガラクトシダーゼ)遺伝子で置換したTNAP(組織非特異型アルカリフォスファターゼ)ノックアウトマウスを用い、lacZ発現を指標としてPGCを分離、純化する方法を開発した.すなわち、PGCを含む胚体組織を解離し、細胞懸濁液を得、これにβ-ガラクトシダーゼの蛍光基質であるFDGを細胞内を取り込ませ、セルソーターを用いてlacZ陽性細胞を検出、単離するというものである.lacZ陽性を示す細胞がPGCであることを確かめるため、単離した蛍光陽性の細胞に対していくつかのPGCマーカーによる染色を行った。まずアルカリフォスファターゼ染色をのすると蛍光陽性細胞の95^〜98%が染色されることが判明した。染色される細胞は、典型的な始原生殖細胞の形態を持つことが確かめられた。また、PGCの増殖に必須なチロシンキナーゼであるc-Kitの抗体で染めたところ、やはり^〜98%の細胞が染色された。これらの結果より、今回用いた手法により、PGCを従来の方法では得ることできなかった非常に高い純度で単離することができることが明らかになった。また、神経冠細胞においてレポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを樹立し、このマウスでは移動期以降の神経冠細胞、或いはそれに由来する組織を特異的にマークすることができることを示した.この系統を利用し、神経冠細胞の細胞系譜解析や上記の技術を利用しての神経冠細胞の単離実験を行っている.

原始生殖细胞（PGC）和神经rest细胞都具有干细胞特性，并在胚胎体内迁移，同时保留多元文化能力。取决于它们到达末端的微环境，PGC分化为生殖细胞，然后神经rest细胞进入神经组织，间充质系统，内分泌组织等。维持这些细胞或区分各种细胞的多元文化潜力的机制在遗传水平上仍然尚不清楚。这可能是因为在胚胎发育过程中只有这种类型的干细胞，并且很难分离，因此我们尚未到达直接分析那里表达的基因的阶段。人们认为，以某种方式标记这些细胞，将它们隔离，然后从各个角度进行分析很重要。因此，在这项研究中，我们首先进行了一个实验，目的是建立一种用于纯化和隔离小鼠PGC的技术。具体而言，我们开发了一种方法，使用TNAP（非组织特异性碱性磷酸酶）敲除小鼠分离和纯化PGC，其中碱性磷酸酶（PGCS的标志物）与LACZ（Escherichia coliβ-乳糖苷酶）基因，使用LACZ表达方式作为指标。换句话说，我们将含有PGC的确定组织分离，获得细胞悬浮液，并将FDG（β-半乳糖苷酶的荧光底物）融合到细胞中，并使用细胞分类器检测和分离Lacz阳性细胞。为了确认表现出LACZ阳性的细胞是PGC，我们用几个PGC标记染色了分离的荧光阳性细胞。首先，发现当碱性磷酸酶染色时，将95^-98％的荧光阳性细胞染色。染色的细胞被证实具有典型的原始生殖细胞形态。此外，当用C-KIT抗体染色时，酪氨酸激酶对PGC生长必不可少， ^至98％的细胞被染色。这些结果表明，本研究中使用的方法允许将PGC分离为非常高的纯度，这是无法通过常规方法获得的。我们还建立了在神经rest细胞中表达报告基因的转基因小鼠，表明这些小鼠可以在迁移阶段或从中得出的组织后特异性标记神经rest细胞。使用这种谱系，我们使用上述技术对神经rest细胞和实验进行了细胞谱系分析，以分离神经rest细胞。