Snyder libraryによる酵母の環境ストレス応答性遺伝子の単離と機能解析

使用 Snyder 文库分离酵母环境应激反应基因并进行功能分析

基本信息

批准号：
08760081
负责人：
井上善晴
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760081/
关键词：
Saccharomyces cerevisiae ストレス過酸化脂質活性酵素環境

项目摘要

Snyder libraryは、プロモーターを欠失させた大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)と、Saccharomyces cerevisiae中での選択マーカーとしてのLEU2遺伝子が、S.cerevisiaeの染色体DNAを含むplasmid libraryにランダムに導入されたものである。このplasmid libraryからlacZ-LEU2を含む酵母の染色体DNA部分を切り出し、宿主酵母の染色体へ導入する。宿主酵母としては2倍体を用いる。その理由としては、lacZ-LEU2部分を宿主染色体へ導入した場合、その導入部分は相同組み換えにより置換破壊されるため、必須遺伝子であった場合、致死となってしまいその後の解析が不可能となるためである。今回、酸化的ストレス応答性遺伝子のクローニングの試みとして、過酸化脂質であるtert-ブチルヒドロペルオキシド(t-BHP)によって発現レベルが変化するクローンのスクリーニングを行った。約3000株のコロニーバンクをそれぞれ2枚のナイロン膜へ転写後、一方はそのまま最小培地へ移し、もう一方はt-BHP含有の最少培地へ移し28℃で培養しコロニーを形成させた。その後、ナイロン膜を液体窒素へ浸し室温で放置し細胞膜を凍結・融解により破壊した。その後ナイロン膜をX-galを含む緩衝液へ浸しコロニーの発色を観察した。その結果、t-BHPの有無によって青色の異なるクローンがいくつか得られた。得られたクローンを更に精査し、過酸化脂質に起因する活性酸素ストレスによって誘導的にβ-ガラクトシダーゼ活性が変化するクローンを3つを得た。1番目のクローンは四分子解析の結果、LEU2^+とβ-ガラクトシダーゼ活性はリンクして2:2分離を示した。2番目のクローンも2:2分離を示したが、3番目のクローンは調べたいくつかの胞子については発芽せず、致死性を示した。しかし、発芽可能であった胞子がLEU2^+でありβ-ガラクトシダーゼ活性を示したことから、3番目のクローンでは少くとも2ケ所でlacZ-LEU2断片の染色体への挿入が起こっていると考えられた。1番目のクローンでは、挿入部分をYIp5を用いてrescueし塩基配列を決定したところ2-デオキシグルコース-6ーリン酸ホスファターゼをコードするDOG2遺伝子内にlacZ-LEU2断片が挿入されていた。同様に、2番目と3番目のクローンについても挿入部位を特定したところ、両クローンとも酵母におけるレトロトランスポゾンであるTy1エレメントのうちのTyA遺伝子中に挿入されていた。これらのクローンのうち、DOG2遺伝子中に挿入されたクローンについて更に解析を行ったところ、DOG2-lacZ融合遺伝子の発現は、ジアミドやエタクリル酸などの細胞内グルタチオン枯渇剤やCd^<2+>によっても誘導された。

Snyder文库是将来自大肠杆菌的启动子缺失的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)和作为酿酒酵母中的选择标记的LEU2基因随机导入到含有酿酒酵母染色体DNA的质粒文库中的质粒文库。它是这样的东西从该质粒文库中切下含有 lacZ-LEU2 的酵母染色体 DNA 部分，并将其引入宿主酵母的染色体中。使用二倍体宿主酵母。其原因是，当lacZ-LEU2部分被引入宿主染色体时，引入的部分会被同源重组所取代和破坏，所以如果它是必需基因，它将是致命的，后续分析将是不可能的。出于某种原因。为了克隆氧化应激反应基因，我们筛选了表达水平被过氧化脂质叔丁基氢过氧化物（t-BHP）改变的克隆。每个菌落库约3000个菌株转移到两片尼龙膜上后，一个直接转移到基本培养基上，另一个转移到含有t-BHP的基本培养基上并在28℃下培养形成菌落。然后，将尼龙膜浸入液氮中并置于室温下，通过冷冻和解冻破坏细胞膜。然后，将尼龙膜浸入含有X-gal的缓冲溶液中，观察菌落的显色。结果，根据t-BHP的存在或不存在，获得了具有不同蓝色的几个克隆。我们进一步检查了获得的克隆，发现三个克隆的β-半乳糖苷酶活性因脂质过氧化物引起的活性氧应激而诱导改变。第一个克隆的四分体分析表明 LEU2^+ 和 β-半乳糖苷酶活性以 2:2 的比例关联和分离。第二个克隆也显示出 2:2 分离，但第三个克隆没有发芽，并且对某些测试的孢子是致命的。然而，由于能够萌发的孢子是LEU2^+并且显示出β-半乳糖苷酶活性，因此认为lacZ-LEU2片段被插入到第三个克隆Ta的染色体中的至少两个位置。在第一个克隆中，使用YIp5拯救插入部分并确定碱基序列，发现lacZ-LEU2片段插入到编码2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶的DOG2基因中。类似地，当第二个和第三个克隆的插入位点被识别时，两个克隆都被插入到Ty1元件的TyA基因中，Ty1元件是酵母中的逆转录转座子。在这些克隆中，我们进一步分析了插入DOG2基因的克隆，发现DOG2-lacZ融合基因的表达受到细胞内谷胱甘肽消耗剂如二酰胺和乙基丙烯酸或Cd 2+ 的抑制。亦诱发。