細胞増殖及び色素体分化にともなう植物ミトコンドリアゲノムの機能的分化

细胞增殖和质体分化过程中植物线粒体基因组的功能分化

基本信息

批准号：
08740612
负责人：
酒井敦
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08740612/
关键词：
色素体色素体核タバコ転写 DNA合成 BY-2 ミトコンドリアミトコンドリア核

项目摘要

タバコ培養細胞BY-2からミトコンドリア核を単離する手法を確立した。この際、細胞核と色素体核も同時に単離することができる。対数増殖期の細胞約10^9個を出発材料とした場合、ミトコンドリア核の収率は5%で、収量は80μgDNAであった。サザンハイブリダイゼーションにより細胞核DNAおよび色素体DNAの混入率を測定した結果、単離ミトコンドリア核の純度は98%であった。分化にともなうミトコンドリアゲノムの機能変化を明らかにするために、タバコ緑葉からミトコンドリア核を単離する方法の開発も行っているが、収量の点でなお改善が必要である。BY-2から単離したミトコンドリア核を適当な条件下でインキュベートすると、[5,6-^3H]UTPを高分子画分に取り込む活性を示す(7pmol/μgDNA/hr)。この活性はDNAおよびタンパク質に依存したRNA合成であり、アクチノマイシンDやEB、N-ethylmaleimide、ヘパリンにより阻害されるが、α-アマニチン、リファンピシン、タゲチトキシン、ナリジキシン酸、及びノボビオシンでは阻害されない。in vitroで合成されたRNAは、ミトコンドリアDNAと特異的にハイブリダイズした。単離ミトコンドリア核はまた、[5-^3H]dCTPの取り込み活性も示す(48pmol/μgDNA/hr)。この活性はDNAおよびタンパク質に依存したDNA合成であり、アクチノマイシンDやEB、N-ethylmaleimide、ddCTP、ヘパリンにより阻害されるが、アフィデイコリン、ナリジキシン酸、ノボビオシンでは阻害されない。in vitroで合成されたDNAの制限酵素解析の結果、DNA合成はミトコンドリアDNAの全領域にわたって起きていることが明らかになった。また、ミトコンドリア核構成タンパク質をSDS-PAGE後、ゲル内DNAポリメラーゼアッセイにかけたところ、分子量約116kDaのDNAポリメラーゼが検出された。本研究の結果、単離ミトコンドリア核のDNA合成反応の至適条件や各種阻害剤に対する応答、DNAポリメラーゼの分子量などは、単離色素体核のそれらと極めて類似していることが明らかになった。この色素体及びミトコンドリアのDNA合成装置の類似性は、両オルガネラのDNAの合成が、細胞増殖初期にそろって活性化される機構を説明するものかもしれない。

已经建立了一种从烟草培养细胞BY-2分离线粒体核的方法。目前，也可以同时分离细胞核和色素核。当对数增殖期间的细胞约为10^9时，线粒体核的产率为5％，产量为80μgDNA。由于通过南部杂交测量了细胞核DNA和色素DNA的混合比，分离线粒体核的纯度为98％。为了阐明与分化相关的线粒体基因组功能的变化，我们还开发了一种从烟草绿叶中分离线粒体核的方法，但有必要提高产量。从BY-2分离的线粒体核孵育[5,6-^3H] UTP用于将UTP掺入聚合物框架（7 pmol/μgdna/hr）中。该活性是RNA的合成，取决于DNA和蛋白质，并被放线肌蛋白D，EB，N-乙基马来酰亚胺，肝素抑制，但不受α-氨氨酸，rifampicine，rifampicine，tartagitoxine，tartocinoxine，tagitoxine，narigicin和Novobiocin的抑制。体外合成的RNA已与线粒体DNA特别杂交。分离线粒体核还显示了[5-^3H] DCTP进口活性（48 pmol/μgDNA/hr）。该活性是DNA的合成，取决于DNA和蛋白质，并被放线肌蛋白D，EB，N-乙基马来酰亚胺，DDCTP和肝素所抑制，但并未受到Apalloglin，Narigyticac Acid或Novebobobiosin的抑制。由于对体外DNA合成的DNA分析有限，已经表明DNA合成发生在线粒体DNA的所有区域。在SDS-PAGE后将线粒体核蛋白应用于凝胶中的DNA聚合酶测定后，检测到分子量约为116 kDa的DNA聚合酶。这项研究的结果是，已经表明，分离线粒体核的DNA合成反应的最佳条件，对各种抑制剂的响应，DNA聚合酶的分子量等与分离的分离的分子量非常相似身体。。该色素和线粒体DNA合成装置的相似性可以解释在细胞增殖的早期阶段两种有机DNA的合成的机理。