ニッケル含有酵素であるウレアーゼの構造と機能

含镍酶脲酶的结构和功能

基本信息

批准号：
06740506
负责人：
山口和也
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至 1994
项目状态：
已结题

项目摘要

光合成細菌にニッケル含有酵素ウレアーゼが存在することは、これまでほとんど知られていない。本研究において、紅色無硫黄細菌であるRhodobacter capsulatusがウレアーゼを生合成することを見いだし、さらにこの細菌のウレアーゼを単離精製することに初めて成功した。この光合成細菌は、通常の生育条件下ではウレアーゼを生合成することなく生育する。ところが、窒素源をアンモニウムイオンから尿素・アルギニン等に変え、窒素代謝系を制御することにより、この菌体におけるウレアーゼ生合成を誘導することができた。また、窒素飢餓条件下にすることで生合成されるウレアーゼの量が増加することも明らかになった。さらに、ウレアーゼ生合成過程においてニッケルイオンを添加するとウレアーゼ活性が著しく促進されることより、この細菌のウレアーゼも他の菌体のものと同様にニッケルを含む酵素であることも示唆された。光合成細菌中の色素や複合タンパク質の生成をおさえ、より多くのウレアーゼの単離精製を行なうために、暗所好気的条件下で培養した細菌からウレアーゼの精製を行なった。ウリアーゼ精製の際に用いるバッファーに2-メルカプトエタノールを添加することにより、精製効率は飛躍的に向上することが明らかになった。この添加剤は酵素の活性中心である複核ニッケルに架橋することにより酵素を安定化させる働きをしているものと考えられる。さらにイオン交換・疎水クロマト法により、従来単離されなかった光合成細菌のウレアーゼの精製に成功し、酵素比活性は38μmol(Urea)/min.mgまで向上した。SDSゲル電気泳動により、サブユニットの分子量は67KDであることも判明した。本研究により、高度に精製された新規の光合成細菌ウレアーゼが得られ、ウレアーゼの構造と機能の関連性を解明し生体中におけるニッケルイオン役割を明らかにするための礎が得られた。

到目前为止，人们对光合细菌中是否存在含镍脲酶还知之甚少。在本研究中，我们发现荚膜红杆菌（Rhodobacter capsulatus）是一种紫色非硫细菌，能够生物合成脲酶，并首次成功地从该细菌中分离纯化脲酶。这种光合细菌在正常生长条件下无需生物合成脲酶即可生长。然而，通过将氮源从铵离子改为尿素、精氨酸等并控制氮代谢系统，我们能够在该细菌细胞中诱导脲酶生物合成。研究还表明，在氮饥饿条件下，生物合成的脲酶的量会增加。此外，在脲酶生物合成过程中添加镍离子显着促进了脲酶活性，表明该细菌的脲酶与其他细菌细胞的脲酶一样是含镍酶。为了抑制光合细菌中色素和复合蛋白的产生，分离和纯化更多的脲酶，我们从黑暗、有氧条件下培养的细菌中纯化了脲酶。结果表明，通过在用于尿酶纯化的缓冲液中添加2-巯基乙醇，可以显着提高纯化效率。这种添加剂被认为通过交联双核镍（酶的活性中心）来稳定酶。此外，利用离子交换和疏水层析，我们成功地从以前未分离过的光合细菌中纯化出了脲酶，酶比活性提高至38 μmol（Urea）/min.mg。通过SDS凝胶电泳还发现该亚基的分子量为67KD。通过本研究，我们获得了一种高度纯化的新型光合细菌脲酶，为阐明脲酶结构与功能之间的关系以及阐明镍离子在生物体中的作用提供了基础。