新たな乳がん幹細胞誘導因子としてのPRDM14の機能解析

PRDM14作为新型乳腺癌干细胞诱导剂的功能分析

• 批准号: 16K21519
• 负责人: 諏訪 喜昭
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kwansei Gakuin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16K21519/
• 关键词: 転写制御; エピジェネティクス; 癌; 幹細胞; 構造生物学

本研究提案では、マウスの生殖系列・多能性幹細胞の成立・維持に必須の因子である転写制御因子PRDM14によるがんの悪性化、がん幹細胞形成・維持機構の解明を目的としている。がん細胞での解析を行う前に、まずマウスES細胞におけるPRDM14による多能性幹細胞の成立・維持の詳細を明らかとするため、マウスES細胞においてドキシサイクリン依存的にPrdm14の発現誘導を行い、PRDM14の標的遺伝子に対するエピジェネティックな修飾の変化の解析を行った。その結果、速やかなヒストンH3アセチルの減少およびH3K27のトリメチル化の増加が見られた。また同時に、CBFA2T2, HDAC1, CTBP2, SUZ12といったヒストン修飾に関わる因子のリクルートの促進が観察された。そこで、PRDM14による多能性の維持・獲得に対するPRC2複合体の関与を検証するため、PRDM14とPRC2複合体との相互作用を確認したところ、弱いながらもPRDM14とPRC2複合体の構成因子のひとつであるSUZ12との相互作用が観察された。同時に、CRISPR/Cas9によりSuz12をノックアウトした細胞を樹立し、PRDM14による転写制御の解析を行ったところ、興味深いことに一部の標的遺伝子において転写抑制のみならず転写活性化においても減弱が見られた。これらのことから、PRDM14はPRC2と複合体を形成し転写を制御することで多能性の獲得・維持に関わることが示唆された。一方で、PRDM14が形成する複合体の立体構造解析のため大腸菌を用いた発現系の構築を行った。完全長PRDM14では、発現量が低くまた、高純度精製が困難であったため最終的な収量が少なく構造解析に必要なタンパク質を得ることができなかった。そこで、PRドメインのみの発現系の構築・高純度精製を試み、高純度なタンパク質を得ることに成功した。

该研究计划旨在阐明转录调节因子PRDM14的癌症恶性转化以及癌症干细胞形成和维持的机制，PRDM14是小鼠生殖细胞和多能干细胞建立和维持的重要因素。在对癌细胞进行分析之前，为了阐明PRDM14在小鼠ES细胞中建立和维持多能干细胞的细节，我们在小鼠ES细胞中以多西环素依赖性方式诱导Prdm14的表达，我们分析了PRDM14的变化。目标基因的表观遗传修饰。结果，观察到组蛋白 H3 乙酰基的快速减少和 H3K27 三甲基化的增加。同时，观察到参与组蛋白修饰的因子（例如 CBFA2T2、HDAC1、CTBP2 和 SUZ12）的招募得到促进。因此，为了验证PRDM14复合物对多能性的维持和获得的参与，我们确认了PRDM14和PRC2复合物之间的相互作用，发现它是PRDM14和PRC2复合物的构成因素之一，尽管观察到与 SUZ12 的相互作用很弱。同时，我们建立了使用 CRISPR/Cas9 敲除 Suz12 的细胞，并分析了 PRDM14 的转录调控，有趣的是，我们发现一些靶基因不仅转录抑制，而且转录激活也减弱。这些结果表明PRDM14通过与PRC2形成复合物并调节转录来参与多能性的获得和维持。另一方面，我们利用大肠杆菌构建了表达系统来分析PRDM14形成的复合物的三维结构。全长PRDM14表达水平较低，难以纯化至高纯度，​​因此最终产量较低，无法获得结构分析所需的蛋白质。因此，我们尝试构建并高度纯化仅PR结构域的表达系统，并成功获得了高纯度的蛋白质。