骨髄間質細胞からの選択的な神経細胞誘導法の確立とパーキンソンモデルへの移植応用

骨髓基质细胞选择性神经细胞诱导方法的建立及其在帕金森模型中的应用

基本信息

批准号：
15016091
负责人：
出沢真理
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

骨髄間質細胞は採取が容易で培養下にて旺盛に増殖し、倫理的な問題が無い。また免疫拒絶の無い自家移植系の確立が可能である。本研究においては神経系の発生分化に関与するNotch遺伝子の導入とサイトカイン刺激を加えることでほぼ全細胞が選択的に神経細胞に分化する方法を見いだしたので報告する。【結果】ヒトおよびラットの骨髄間質細胞において、Notch細胞内ドメインの遺伝子を導入することによって神経幹細胞様に分化転換することを見いだした。遺伝子導入された細胞は神経幹細胞に特異的なマーカーを発現しpromoter解析においてもそれらの因子の活性が有意に上昇していた。これらの神経幹細胞様に分化転換した骨髄間質細胞にある特定のサイトカイン刺激(bFGF,Forskolin,CNTF)を与えると96〜98%という非常に効率の高い選択的な神経誘導が引き起こされる。誘導された神経細胞は神経マーカーを発現しておりBrd-Uの実験から分裂を終えたpost-mitotic neuronであることが確認された。またパッチクランプ実験においてpotasium currentが計測されに神経細胞であることが示唆された。RT-PCR,luciferaseアッセイ、ウェスタンブロット、免疫組織化学の解析を用いて調べた結果、この最終産物にはグリア細胞が一切含まれておらず、神経細胞だけで最終産物が構成されていた。これらの神経細胞にさらにGDNFを投与することによってTH-陽性細胞が40%近くに増加し、これらの細胞をパーキンソンモデルラットの線状体に移植したところ、apomorphin誘導の回転運動、paw reaching test, adjusting step testにおいて顕著な改善を示した。また脳内でドーパミンを産生し顕著な症状改善を認めた。神経誘導のメカニズムを調べた結果ankyrin repeatsドメインに神経誘導活性の中心があることが分かった。【考察】グリア分化因子とされてきたNotch遺伝子が、神経系とは全く異なる間葉系の骨髄間質細胞に導入すると神経分化に働いたという結果を得た。

骨髓基质细胞易于采集，培养增殖旺盛，不存在伦理问题。此外，可以建立无免疫排斥的自体移植系统。在这项研究中，我们报告说，我们发现了一种通过引入参与神经系统发育和分化的Notch基因并添加细胞因子刺激来选择性地将几乎所有细胞分化为神经细胞的方法。 [结果]我们发现人和大鼠骨髓基质细胞通过引入Notch胞内结构域基因转分化为神经干细胞样细胞。基因转染的细胞表达神经干细胞特有的标记，启动子分析也显示这些因子的活性显着增加。当对这些已转分化为神经干细胞样细胞的骨髓基质细胞施加特异性细胞因子刺激（bFGF、Forskolin、CNTF）时，可诱导 96-98% 的高效选择性神经诱导。诱导的神经元表达神经标志物，Brd-U实验证实它们是已完成分裂的有丝分裂后神经元。在膜片钳实验中，还测量了钾电流，表明它是神经元细胞。 RT-PCR、荧光素酶测定、蛋白质印迹和免疫组织化学分析的结果表明，最终产物不含任何胶质细胞，仅由神经细胞组成。进一步向这些神经元施用GDNF，使TH阳性细胞的数量增加到近40%，并且当将这些细胞移植到帕金森病模型大鼠的纹状体中时，阿扑吗啡诱导的旋转运动、爪子到达试验，显示出明显的改善。调整步骤测试。此外，大脑中还产生多巴胺，导致症状显着改善。通过研究神经诱导机制，我们发现锚蛋白重复结构域是神经诱导活动的中心。 [讨论] 我们得到的结果是，Notch基因被认为是神经胶质分化因子，当导入骨髓基质细胞时，它会作用于神经分化，而骨髓基质细胞是间充质的，与神经系统完全不同。