カルシウムによる成長円錐運動制御機構の解析

钙生长锥运动控制机制分析

基本信息

批准号：
15016017
负责人：
石川良樹
金额：
$ 3.58万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15016017/
关键词：
アクチンミオシンファシン成長円錐フィロポディア

项目摘要

ファシン、およびその活性を調節するカルシウム感受性アクチン結合蛋白質カルデスモン・トロポミオシンの生態観察を行い、これら蛋白質の成長円錐における役割を探った。EGFP-ファシンの遺伝子導入をNg108-15細胞に行い、この蛋白質が成長円錐フィロポディアに局在する事を確認した。さらに、生体観察を行ったところ、ファシンがレトログレード・フローに乗ってフィロポディア先端から後方へと移動する事を見いだした。このことは、アクチン/ファシンの束が一体となって前方から後方へ輸送される事を示唆している。ちなみに、この結果はアクチン以外の蛋白質のレトログレード・フローを観察した初の例である。また、ファシンはC-kinaseによってリン酸化され、アクチン結合能を失う事が知られている。そこで、リン酸化部位をAに置き換えた疑似非リン酸化型、Dに置き換えた疑似リン酔化型変異体を作成して同様の観察を行った。非リン酸化型ファシンではフィロポディアが発達し、アクチン繊維の上にしっかりと乗っていたのに対し、疑似リン酸化型はフィロポディア上に局在していなかった。以上の事から、ファシンのリン酸化がフィロポディア動態と密接に関与している可能性を示唆出来た。カルデスモンとトロポミオシンは協調してファシンの束化活性を阻害し、Ca2+/calmodulinにより、阻害が解除される。EGFP-カルデスモンを過剰発現させたところ、カルデスモンもレトログレード・フローに乗ってフィロポディア先端から後方へと移動した。現在、この細胞、及びEGFP-トロポミオシンとEGFP-カルデスモンの共発現細胞において、フィロポディアの形態観察を行っているところである。

我们观察了肌成束蛋白和调节其活性的钙敏感性肌动蛋白结合蛋白卡尔德斯蒙原肌球蛋白的生物学，并研究了这些蛋白质在生长锥中的作用。我们将EGFP-肌成束蛋白转染到Ng108-15细胞中，并证实该蛋白定位于生长锥丝状伪足中。此外，当我们进行生物学观察时，我们发现肌成束蛋白在逆行流中从丝状伪足的尖端向后移动。这表明肌动蛋白/肌成束蛋白束作为一个单元从前到后运输。顺便提及，该结果是首次观察到肌动蛋白以外的蛋白质的逆行流动。还已知肌成束蛋白被C-激酶磷酸化并失去其肌动蛋白结合能力。因此，通过创建假非磷酸化突变体（其中磷酸化位点被 A 取代）和假磷中毒突变体（其中磷酸化位点被 D 取代）进行了类似的观察。在肌成束蛋白的非磷酸化形式中，丝状伪足发育并牢固地停留在肌动蛋白纤维上，而在假磷酸化形式中，丝状伪足不定位。这些结果表明肌成束蛋白磷酸化可能与丝状伪足动力学密切相关。钙结合蛋白和原肌球蛋白协同抑制肌成束蛋白的成束活性，并且这种抑制作用由Ca2+/钙调蛋白释放。当EGFP-caldesmon过表达时，caldesmon也随着逆流从丝状伪足尖端向后迁移。我们目前正在观察这些细胞以及共表达 EGFP-原肌球蛋白和 EGFP-caldesmon 的细胞中丝状伪足的形态。