骨髄幹細胞の可塑性とそのメカニズム

骨髓干细胞的可塑性及其机制

基本信息

批准号：
14081202
负责人：
中内啓光
金额：
$ 77.76万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

1)造血幹細胞の多様性と階層性の解明5あるいは6カラー解析とソーティングを用いることにより高度に純化された造血幹細胞分画であるCD34-KSL細胞をさらに他の抗原で細分画することを試みた。50以上の抗体をスクリーニングしたが、CD34-KSL分画をさらに一部のみ染色する抗体は僅かで、ほとんどは全て陽性あるいは陰性であった。その中でSLAMファミリーの一つで造血幹細胞のマーカーとして最近報告されたCD150はCD34-KSL細胞をある程度分画したのでCD150強陽性CD34-KSL細胞とCD150陰性CD34-KSL細胞について移植実験を行った。その結果、どちらの分画も同じ頻度で長期骨髄再建能を持つ細胞を含んでいたが、CD150強陽性分画の細胞の方が立ち上がりが遅い傾向が認められ、CD150の発現と造血幹細胞の未分化性に相関があることが示唆された。同様にSP分画細胞とCD34-KSL細胞を6カラー解析によって詳細に解析を行ったところCD34-KSL細胞の半分はSP分画にあるが、半分は非SP分画にあること、そしてどちらの分画にも同じ数の造血幹細胞が含まれていて活性も同等であった。Bcrp-1の発現は遺伝子レベル、タンパクレベルでも差はなかった。さらにSP-CD34-KSL細胞を移植しても非SP-CD34-KSL細胞が出現するし、その逆も起こりえることが示された。また、bcrp-1を造血幹細胞に遺伝子導入して強制発現させるとSP細胞は増加したが、そこに含まれる造血幹細胞の数は増加していなかった。以上より、bcrp-1の発現が造血幹細胞活性とかなり強く相関しているものの、造血幹細胞の自己複製や分化とbcrp-1の機能の間には直接的な関連性は低いことが示唆された。2)造血幹細胞の多分化能および自己複製能を規定する分子の同定アダプター分子であるLnkが自己複製を負に制御すること、Lnk欠損造血幹細胞が野生型造血幹細胞に比してTPOに対して高感受性であり、TPOの刺激によって有意に対称性自己複製の頻度が高くなることを実験的に示した。これらのデータはLnkがTPOの受容体であるc-mplの下流にある自己複製シグナルを負に制御する分子であることを示している。そこでc-mpl下流のどのシグナル伝達経路が関与しているかを明らかにするため、我々が開発したin-droplet single cell immunostaining法を基本にしたSingle Cell Immunophophorylation AssayによりTPO刺激後の各種シグナル伝達系のリン酸化状況を解析した。その結果、Lnk欠損造血幹細胞においてはSTAT5ならびにAktのリン酸化が野生型造血幹細胞と比較して著明に亢進していること、P38MAPKの不活性化が亢進していることが示され、造血幹細胞の自己複製に関与するシグナル伝達系を始めて明らかにすることができた。

1）阐明造血干细胞的多样性和层次结构5或6，我们尝试使用颜色分析和分类来降低分流的CD34-KSL细胞，这是一种高度纯化的造血干细胞分数，具有其他抗原。筛选了50多种抗体，但只有少数抗体仅染色CD34-KSL馏分的一部分，其中大部分是阳性或阴性的。其中，CD150最近被报道为一个大型家族中的造血干细胞的标记，在某种程度上分离了CD34-KSL细胞，因此在CD150阳性CD34-KSL细胞和CD150阴性CD34-KD34-KSL细胞上进行了移植实验。结果表明，这两种馏分都包含具有相同频率和长期骨髓收集能力的细胞，但是具有高度阳性CD150馏分的细胞趋于较慢，这表明CD150表达和造血干细胞的不分化之间存在相关性。同样，使用六色分析对SP级分细胞和CD34-KSL细胞进行了详细分析，发现一半的CD34-KSL细胞在SP级分中，但一半均在非SP级分中，并且两个分数都包含相同数量的血肿细胞，并且活性是相当的。 BCRP-1在基因或蛋白质水平上的表达没有差异。此外，还表明，即使植入了SP-CD34-KSL细胞，也会出现非SP-CD34-KSL细胞，反之亦然。此外，当将BCRP-1转染到造血干细胞并强迫表达SP细胞时增加时，其中包含的造血干细胞的数量并没有增加。从以上，尽管BCRP-1表达与造血干细胞活性显着相关，但建议造血干细胞自我更新和分化与BCRP-1功能之间几乎没有直接关联。 2) Identification of molecules that define the multipotential and self-renewal ability of hematopoietic stem cells We experimentally demonstrated that Lnk, an adaptor molecule, negatively regulates self-renewal, and that Lnk-deficient hematopoietic stem cells are more sensitive to TPO than wild-type hematopoietic stem cells, and that stimulation of TPO results in a significantly higher frequency of对称的自我更新。这些数据表明LNK是一个分子，对C-MPL（TPO受体）下游负调节自我更新信号。为了澄清C-MPL下游的哪些信号通路，我们使用单个细胞免疫测定测定法基于我们开发的单细胞免疫染色方法，分析了TPO刺激后各种信号系统的磷酸化状态。结果表明，与野生型造血干细胞相比，STAT5和AKT的磷酸化显着增加，在LNK缺陷型造血干细胞中，p38mapk的失活显着增加，允许首次揭示出涉及自我恢复性血液元素的信号传输系统的首次揭示信号转移系统。