骨髄幹細胞の可塑性とそのメカニズム

骨髓干细胞的可塑性及其机制

基本信息

批准号：
14081202
负责人：
中内啓光
金额：
$ 77.76万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

1)造血幹細胞の多様性と階層性の解明5あるいは6カラー解析とソーティングを用いることにより高度に純化された造血幹細胞分画であるCD34-KSL細胞をさらに他の抗原で細分画することを試みた。50以上の抗体をスクリーニングしたが、CD34-KSL分画をさらに一部のみ染色する抗体は僅かで、ほとんどは全て陽性あるいは陰性であった。その中でSLAMファミリーの一つで造血幹細胞のマーカーとして最近報告されたCD150はCD34-KSL細胞をある程度分画したのでCD150強陽性CD34-KSL細胞とCD150陰性CD34-KSL細胞について移植実験を行った。その結果、どちらの分画も同じ頻度で長期骨髄再建能を持つ細胞を含んでいたが、CD150強陽性分画の細胞の方が立ち上がりが遅い傾向が認められ、CD150の発現と造血幹細胞の未分化性に相関があることが示唆された。同様にSP分画細胞とCD34-KSL細胞を6カラー解析によって詳細に解析を行ったところCD34-KSL細胞の半分はSP分画にあるが、半分は非SP分画にあること、そしてどちらの分画にも同じ数の造血幹細胞が含まれていて活性も同等であった。Bcrp-1の発現は遺伝子レベル、タンパクレベルでも差はなかった。さらにSP-CD34-KSL細胞を移植しても非SP-CD34-KSL細胞が出現するし、その逆も起こりえることが示された。また、bcrp-1を造血幹細胞に遺伝子導入して強制発現させるとSP細胞は増加したが、そこに含まれる造血幹細胞の数は増加していなかった。以上より、bcrp-1の発現が造血幹細胞活性とかなり強く相関しているものの、造血幹細胞の自己複製や分化とbcrp-1の機能の間には直接的な関連性は低いことが示唆された。2)造血幹細胞の多分化能および自己複製能を規定する分子の同定アダプター分子であるLnkが自己複製を負に制御すること、Lnk欠損造血幹細胞が野生型造血幹細胞に比してTPOに対して高感受性であり、TPOの刺激によって有意に対称性自己複製の頻度が高くなることを実験的に示した。これらのデータはLnkがTPOの受容体であるc-mplの下流にある自己複製シグナルを負に制御する分子であることを示している。そこでc-mpl下流のどのシグナル伝達経路が関与しているかを明らかにするため、我々が開発したin-droplet single cell immunostaining法を基本にしたSingle Cell Immunophophorylation AssayによりTPO刺激後の各種シグナル伝達系のリン酸化状況を解析した。その結果、Lnk欠損造血幹細胞においてはSTAT5ならびにAktのリン酸化が野生型造血幹細胞と比較して著明に亢進していること、P38MAPKの不活性化が亢進していることが示され、造血幹細胞の自己複製に関与するシグナル伝達系を始めて明らかにすることができた。

1) 阐明造血干细胞的多样性和等级。通过5或6色分析和分选，我们将尝试使用其他抗原进一步细分CD34-KSL细胞（一种高度纯化的造血干细胞部分）。筛选了 50 多种抗体，但只有少数抗体仅对 CD34-KSL 部分的一部分进行染色，并且几乎全部呈阳性或阴性。其中，CD150是SLAM家族的一员，最近被报道作为造血干细胞的标记物，它能够在一定程度上分离CD34-KSL细胞，因此我们用CD150强阳性的CD34-进行移植实验。 KSL 细胞和 CD150 阴性 CD34-KSL 细胞。结果，两个级分均以相同的频率含有具有长期骨髓再生能力的细胞，但 CD150 强阳性级分中的细胞往往上升较慢，表明 CD150 表达与造血干细胞存在相关性。与分化的相关性。类似地，通过6色分析对SP分级细胞和CD34-KSL细胞进行详细分析显示，一半的CD34-KSL细胞在SP级分中，但一半在非SP级分中，并且这些级分含有相同的造血干细胞数量和活性相似。 Bcrp-1 表达在基因或蛋白质水平上没有差异。此外，显示即使移植SP-CD34-KSL细胞，也会出现非SP-CD34-KSL细胞，反之亦然。此外，当将bcrp-1基因导入造血干细胞并强制表达时，SP细胞的数量增加，但其中所含的造血干细胞的数量没有增加。这些结果表明，虽然bcrp-1的表达与造血干细胞活性密切相关，但造血干细胞的自我更新和分化与bcrp-1的功能之间几乎没有直接关系。 2）鉴定造血干细胞多能性和自我更新能力的分子，Lnk是一种接头分子，负向调节自我更新，Lnk缺陷的造血干细胞比野生型造血干细胞对TPO更敏感。实验表明，TPO 刺激显着增加对称自我更新的频率。这些数据表明Lnk是一种对TPO受体c-mpl下游的自我更新信号进行负调节的分子。因此，为了明确c-mpl下游的哪个信号转导通路参与，我们基于我们开发的滴内单细胞免疫染色方法进行了单细胞免疫磷酸化状态分析。结果表明，与野生型造血干细胞相比，Lnk缺陷的造血干细胞中STAT5和Akt的磷酸化显着增强，并且P38 MAPK的失活增强，我们首次能够阐明信号转导系统。参与自我更新。