RNA合成における翻訳因子の役割の解明

阐明翻译因子在 RNA 合成中的作用

• 批准号: 20051030
• 负责人: 富田 耕造
• 金额: $ 4.22万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20051030/
• 关键词: RNA合成; 翻訳因子; 構造解析; 複合体; RNA依存性RNA合成酵素; 結晶構造

Qβファージの複製酵素はQβファージ自身のRNAゲノムにコードされているβサプユニット(レプリケース)の他に宿主である大腸菌由来の翻訳伸長因子であるEF-Tu、EF-Ts、リボゾーマルタンパク質S1を含む複合体である。我々は、Qβファージ由来のRNA依存性RNA合成酵素(RNA dependent RNA polymerase : RdRp)であるQβ複製酵素複合体のX線結晶構造解析、機能解析を通して、RNA合成における翻訳因子の役割、そして、RNA依存性RNA合成酵素のRNA合成の動的分子基盤を明らかにすることを目的として研究を進めている。本申請課題にて、レプリケース、EF-Tu、EF-Ts三者複合体と、レプリケース、EF-Tu、EF-Ts、S1四者複合体を複合体として大腸菌にて大量に発現、精製するスキームを試みてきた。EF-Tu、EF-Ts、S1四者複合体に関して結晶が得られたが、十分な分解能が得られる良質な結晶ではなく、また結晶化の再現性も得られなかった。そこで、レプリケース、EF-Tu、EF-Tsをアミノ酸リンカーでつないだタンパク質の精製、結晶化を試みた。この一本鎖にしたタンパク質は、通常のEF-Tu、EF-Tsの三者複合体と同様に、34ヌクレオチドのモデルRNAを鋳型として、それに相補的なRNAを合成できることを確認している。そこで、一本鎖にしたタンパク質を大量に発現し、精製するスキームを確立し、結晶化を行ったところ、PEG400を沈殿剤とした条件で良質な結晶を再現性よく、確実に得ることができた。つくばの放射光施設Photon FactolyのビームラインBL-17AでX線回折実験を行い、分解能2.8Åでデータ収集を行った。空間群はC222_1であり、格子定数はa=139.9Å、b=250.1Å、c=101.2Åであった。セレノメチオニン置換体タンパク質をもちいて結晶化を行い、得られた結晶を用いてMAD法によって3.1Åの分解能で位相の決定に成功した。現在、モデル構築、精密化を行っている段階である。今後、得られた構造から、QβレプリケースによるRNA合成の分子基盤の一端が明らかにされると期待している。

Qβ噬菌体的复制酶包括Qβ噬菌体自身RNA基因组中编码的β亚基（复制酶），以及源自宿主大肠杆菌的翻译延伸因子EF-Tu和EF-Ts，以及核糖体蛋白。含有S1。通过对 Qβ 复制酶复合物（一种源自 Qβ 噬菌体的 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp)）的 X 射线晶体结构分析和功能分析，我们研究了翻译因子在 RNA 合成中的作用，我们正在进行研究，目的是澄清依赖RNA合酶进行RNA合成的动态分子基础。在这个应用项目中，我们在大肠杆菌中表达并纯化了大量的Replicase、EF-Tu、EF-Ts三部分复合物和Replicase、EF-Tu、EF-Ts、S1四部分复合物，我尝试了一个方案。做这个。尽管获得了 EF-Tu、EF-Ts 和 S1 四路复合物的晶体，但它们的质量不高，分辨率不够，而且结晶不可重现。因此，我们尝试纯化并结晶用氨基酸接头连接复制酶、EF-Tu和EF-Ts的蛋白质。已证实这种单链蛋白可以以34个核苷酸的模型RNA为模板合成互补RNA，类似于正常的EF-Tu和EF-Ts三联复合物。因此，我们建立了表达大量单链蛋白、纯化并进行结晶的方案，我们能够使用 PEG400 作为沉淀剂可靠地获得具有良好重现性的高质量晶体。 X 射线衍射实验是在位于筑波的同步加速器辐射设施 Photon Factory 的光束线 BL-17A 上进行的，并以 2.8 Å 的分辨率收集数据。空间群为C222_1，晶格常数为a=139.9Å、b=250.1Å、c=101.2Å。我们使用硒代蛋氨酸取代的蛋白质进行结晶，并使用MAD方法成功地确定了相位，使用所获得的晶体分辨率为3.1 Å。目前，该模型正在构建和完善中。未来，我们希望所获得的结构能够揭示Qβ复制酶合成RNA的部分分子基础。

项目成果

アミノアシルtRNA蛋白質転移酵素の基質認識、反応触媒の分子機構の解明

阐明氨酰-tRNA蛋白转移酶底物识别和反应催化的分子机制

• 发表时间: 2009
• 期刊: 生化学、日本生化学会 81
• 作者: 渡邉和則;董雪松;富田耕造
• 通讯作者: 富田耕造

Mechanism for the definition of elongation and termination by the class II CCA-adding enzyme

• DOI: 10.1038/emboj.2009.260
• 发表时间: 2009-11-04
• 期刊: EMBO JOURNAL
• 影响因子: 11.4
• 作者: Toh, Yukimatsu;Takeshita, Daijiro;Tomita, Kozo
• 通讯作者: Tomita, Kozo

クラスII CCA付加酵素によるRNA合成伸長-終結を規定する分子メカニズム

II类CCA添加酶调节RNA合成延伸-终止的分子机制

• 发表时间: 2009
• 作者: 董雪松;竹下大二郎;富田耕造
• 通讯作者: 富田耕造

tRNAを使うリボソームによらないペプチド結合形成反応

使用 tRNA 进行不依赖核糖体的肽键形成反应

• 发表时间: 2008
• 期刊: 蛋白質核酵素 53
• 作者: 渡邉和則;富田耕造
• 通讯作者: 富田耕造

Mechanism for the definition of elongation and termination by class II CCA-adding enzyme.

II 类 CCA 添加酶定义延伸和终止的机制。

• 发表时间: 2009
• 期刊: EMBO J. 28
• 作者: Toh;Y.;Takeshita;D.;Nwnata;T.;Fukai;S.;Nureki;O.;Tomita;K.
• 通讯作者: K.