可逆的光活性化蛍光蛋白質Dronpaを用いた細胞内アクチン動態のリアルタイム計測

使用可逆光激活荧光蛋白 Dronpa 实时测量细胞内肌动蛋白动力学

基本信息

  • 批准号:
    20034002
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.86万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    2008
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2008 至 2009
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

本研究課題により、アクチン骨格を構成する単量体アクチンの生細胞内における濃度測定の方法を開発し、さらに、任意の局所におけるアクチン濃度の経時変化を測定する方法を開発することに成功した。可逆的光活性化蛍光蛋白質であるDronpaを融合したアクチンを細胞に発現させ、全体を励起光による退色後、局所のDronpaを光活性化し、その拡散による蛍光減衰曲線から重合したアクチンと拡散する単分子の成分を分離して抽出することで単量体アクチンの濃度を算出するものである。これを連続して行うことで濃度の経時変化を追うことも可能となった。この方法を用いて、細胞運動における単量体アクチン濃度の変化を解析し、細胞が静的状態から刺激依存的な運動を引き起こす際に、細胞内の単量体アクチンを4割程度重合していることが明らかとなった。また、運動時のアクチン重合とアクチン骨格による仮足形成により複雑な過程があることを示唆する結果を得た。さらに、任意の部位における単量体アクチンの濃度変化を測定した結果、細胞内における単量体アクチンの拡散は早く、細胞移動時の前方や後方において単量体アクチンの濃度に有為な差がないことが明らかとなった。本研究で開発した方法は、単量体の分子の濃度の測定に限らず、細胞膜や細胞骨格に結合した分子の量や結合と解離の速度の変化を測定することができる方法であることが示唆された。細胞内の多くの蛋白質は流動的に局在を変化させ、標的となる部位への局在と離脱を繰り返している。本研究によって開発された解析方法はこのような細胞内分子の時空間的制御の解析に有効であると考えられる。
这项研究成功地开发了一种构成肌动蛋白骨骼的单膜活性活性细胞中浓度的方法,并进一步开发了一种测量任何局部肌动蛋白浓度时间变化的方法。肌动蛋白是由于激发光,局部dronpa光学激活而在细胞中表达的反向光电荧光蛋白,并随着荧光衰减线的扩散而散布。通过分离和提取分子的成分。通过不断这样做,随着时间的推移,可以遵循浓度的变化。使用这种方法,分析细胞运动中的单膜肌动蛋白浓度的变化,当细胞引起静态状态的刺激运动时,细胞中约40%的细胞肌动蛋白在细胞中的抛光被抛光约40%。此外,结果表明,由于运动过程中肌动蛋白聚合和肌动蛋白骨架的临时脚形成,因此存在一个复杂的过程。此外,由于在任何部分中测量单膜肌动蛋白的浓度,单体肌动蛋白在细胞中的扩散很快,并且单体肌动蛋白在细胞运动中的浓度存在显着差异很清楚没有。这项研究中开发的方法不限于测量单体分子分子的密度,还可以测量键入细胞膜和细胞骨架的分子量的变化。细胞中的许多蛋白质正在流动地改变定位,并反复从局部部位退出。这项研究开发的分析方法被认为有效地分析了这种细胞内分子的时间和空间控制。

项目成果

期刊论文数量(29)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
コフィリンホスファターゼ Slingshot の活性制御機構と細胞遊走、細胞分裂における機能
Cofilin磷酸酶Slingshot活性调节机制及其在细胞迁移和细胞分裂中的作用
  • DOI:
  • 发表时间:
    2009
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    T.Aoyama;T.Kimura;et al;榎敏明;富永基樹;大橋一正
  • 通讯作者:
    大橋一正
Phosohorylation of Slingshot-1 by Polo-like kinase-1
Polo 样激酶 1 对 Slingshot-1 进行磷酸化
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    大槻美樹;他
  • 通讯作者:
Mitotic activation of NDR1 kinase and its role in chromosome alignment
NDR1 激酶的有丝分裂激活及其在染色体排列中的作用
  • DOI:
  • 发表时间:
    2009
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    池田真教;千葉秀平;大橋一正;水野健作
  • 通讯作者:
    水野健作
LIM-kinase is critical for the mesenchymal-to-amoeboid cell morphological transition in 3D matrices
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纺锤体定位蛋白的定位和肌动蛋白骨架参与哺乳动物细胞的对称分裂
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    林文;他
  • 通讯作者:
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