概日時計システムにおける時計タンパク質の分解タイミングの決定機構

决定生物钟系统中时钟蛋白降解时间的机制

• 批准号: 19044010
• 负责人: 深田 吉孝
• 金额: $ 4.35万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19044010/
• 关键词: 概日時計; 蛋白質キナーゼ; リン酸化; 分解シグナル; プロテアソム; CRY2; CLOCK; 転写調節; プロテアソーム; E4BP4

約1日周期の生物リズムを生み出す概日時計は、一群の時計遺伝子の転写・翻訳を介したフィードバクループにより形成されている。そのため、多くの時計遺伝子の転写は時刻依存的に制御され、その翻訳産物である時計タンパク質は約24時間周期で増減を繰り返す。我々は、このリズミックな転写において、強力な負の制御因子であるCRY2が時刻依存的に「複数のタンパク質キナーゼによる多段階リン酸化」を受け、プロテアソーム系によって分解されることを世界に先駆けて報告した。本年度は、CRY2の多段階リン酸化の引き金を引くプライミングキナーゼを同定することができた。このキナーゼをノックダウンすると、CRY2 Ser557のリン酸化レベルが減弱し、さらにCRY2のタンパク質量が増加した。さらに、このキナーゼのSer557リン酸化活性が大きく日周変動することを見出した。これらの実験結果から同定したキナーゼは、時計細胞においてCRY2のタンパク質量を時刻依存的に制御する重要な因子であると考えられた。このCRY2のリン酸化とタンパク質分解は、主に時計細胞の細胞質において起こるイベントであることを見出した。一方、申請者らは、分子時計の正の制御因子であるCLOCKが時刻依存的にリン酸化されること、さらにこのリン酸化がCLOCKをプロテアソームを介した分解に導く可能性を見出した。本年度は、より直接的な解析を目指してCLOCKリン酸化部位の同定を試みた。具体的には、マウス肝臓の核画分を出発材料に、DEAEカラムおよび抗CLOCKモノクローナル抗体固定化カラムを用いてCLOCK-BMAL1複合体を精製した。こうして得た肝臓のCLOCKを質量分析に供して数多くのリン酸化部位を同定した。現在、これら複数のリン酸化部位のそれぞれの生理的役割を明らかにすべく、変異導入を中心に分子解析を進めている。

生物钟大约产生每天的生物节律，是由一组时钟基因的转录和翻译介导的反馈环路形成的。因此，许多时钟基因的转录以时间依赖性方式受到调节，并且它们的翻译产物、时钟蛋白以大约24小时为周期重复增加和减少。我们是世界上第一个报道 CRY2（这种节律转录的强负调节因子）以时间依赖性方式经历“多种蛋白激酶的多步磷酸化”，并被蛋白酶体系统降解。今年，我们鉴定出了一种引发激酶，可以触发 CRY2 的多步磷酸化。敲除该激酶会减弱 CRY2 Ser557 的磷酸化水平，并进一步增加 CRY2 蛋白的量。此外，我们发现该激酶的 Ser557 磷酸化活性昼夜显着波动。从这些实验结果中鉴定出的激酶被认为是以时间依赖性方式控制时钟细胞中CRY2蛋白量的重要因素。我们发现 CRY2 磷酸化和蛋白水解是主要发生在时钟细胞细胞质中的事件。另一方面，作者发现，分子钟的正调节因子 CLOCK 以时间依赖性方式磷酸化，并且这种磷酸化可能导致蛋白酶体介导的 CLOCK 降解。今年，我们尝试鉴定 CLOCK 磷酸化位点以进行更直接的分析。具体而言，以小鼠肝核级分为起始原料，使用DEAE柱和抗CLOCK单克隆抗体固定柱来纯化CLOCK-BMAL1复合物。对以这种方式获得的肝脏CLOCK进行质谱分析并鉴定出许多磷酸化位点。我们目前正在进行以突变引入为中心的分子分析，以阐明这些多个磷酸化位点的生理作用。

项目成果

概日時計が長期記憶形成を制御する神経システムへの分子的アプローチ

神经系统的分子方法，其中生物钟控制长期记忆的形成

• 发表时间: 2008
• 作者: 村上緑;神山勉;小林洋大
• 通讯作者: 小林洋大

マウスCRY2におけるC末端領域のリン酸化が概日リズム形成に果す役割

小鼠CRY2 C末端区域磷酸化在昼夜节律形成中的作用

• 发表时间: 2008
• 作者: 村上緑;神山勉;小林洋大;村上緑;倉林伸博;神山勉;平野有沙
• 通讯作者: 平野有沙

21世紀の動物科学シリーズ:第9巻『動物の感覚とリズム』の「序章:感覚系と生物時計の対比と連関」の項を分担執筆

21世纪动物科学系列：共同撰写第9卷“动物感官和节律”中的“简介：感觉系统和生物钟之间的比较和联系”部分。

• 发表时间: 2007
• 作者: Hideaki Tomura;Jin-peng Liu;Mayumi Komachi;Wang Ju Qiang;Masayuki Tobo;Hiromi Nochi;Koichi Tamoto;Alatangaole Damirin;Koichi Sato;Chihiro Mogi;and Fumikazu Okajima;Daisuke Kojima;Nobuhiro Nakao;Takahiro Tsuji;Fumiko Shimizu;Naoyuki Asada;Masaki Torii;Hiroaki Mano;Nobuhiro Kurabayashi;Yoko Kubo;Yasutaka Wada;真野 弘明;浅田 直之;小島 大輔;金 尚宏;Hikari Yoshitane;玉井 総一;Masaki Torii;Shimizu Kimiko;Hikari Yoshitane;金 尚宏;景山 伯春;Yoshitaka Fukada;Yoshitaka Fukada;Shimizu Kimiko;白木 知也;深田 吉孝;Yoshitaka Fukada;Daisuke Kojima;Hikari Yoshitane;Nobuhiro Kurabayashi;Naohiro Kon;深田 吉孝(分担執筆);深田 吉孝(分担執筆)
• 通讯作者: 深田 吉孝(分担執筆)

図説 分子病態学 改訂4版の「視覚異常症」の項を分担執筆

与人合着《分子病理学图解》第四修订版中“视觉异常”部分

• 发表时间: 2008
• 作者: Hideaki Tomura;Jin-peng Liu;Mayumi Komachi;Wang Ju Qiang;Masayuki Tobo;Hiromi Nochi;Koichi Tamoto;Alatangaole Damirin;Koichi Sato;Chihiro Mogi;and Fumikazu Okajima;Daisuke Kojima;Nobuhiro Nakao;Takahiro Tsuji;Fumiko Shimizu;Naoyuki Asada;Masaki Torii;Hiroaki Mano;Nobuhiro Kurabayashi;Yoko Kubo;Yasutaka Wada;真野 弘明;浅田 直之;小島 大輔;金 尚宏;Hikari Yoshitane;玉井 総一;Masaki Torii;Shimizu Kimiko;Hikari Yoshitane;金 尚宏;景山 伯春;Yoshitaka Fukada;Yoshitaka Fukada;Shimizu Kimiko;白木 知也;深田 吉孝;Yoshitaka Fukada;Daisuke Kojima;Hikari Yoshitane;Nobuhiro Kurabayashi;Naohiro Kon;深田 吉孝(分担執筆)
• 通讯作者: 深田 吉孝(分担執筆)

Circadian proteomics of the mouse retina.

小鼠视网膜的昼夜节律蛋白质组学。

• DOI: 10.1002/pmic.200700272
• 发表时间: 2007
• 期刊: Proteomics
• 影响因子: 3.4
• 作者: Tsuji,Takahiro;Hirota,Tsuyoshi;Takemori,Nobuaki;Komori,Naoka;Yoshitane,Hikari;Fukuda,Masafumi;Matsumoto,Hiroyuki;Fukada,Yoshitaka
• 通讯作者: Fukada,Yoshitaka