時空間相互相関法を用いた細胞核内ダイナミクスの解析

使用时空互相关方法分析细胞内动力学

• 批准号: 19038001
• 负责人: 金城 政孝
• 金额: $ 5.7万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19038001/
• 关键词: 生物物理; 細胞; 蛍光測定; 細胞核; ゆらぎ; 拡散速度; イメージング; 蛍光相関分光法; 核内微環境; 蛍光寿命

注目している生体分子同士や他の生体分子間の相互作用の強さを生きている細胞内で可視化することは、動的な生体機能を可視化することに直結すると考えた。そこで細胞核内の構造を蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)を利用して, 分子運動の特性に注目して解析し, これまでのイメージング手法では明らかにできなかった核の機能と密接関連したダイナミックな機構が存在する事を目指した。しかし, 拡散測定に基礎をおくFCSだけでは分子量比が極端に大きくないと分子間の相互作用が検出できない、また内在性タンパク質の影響が無視できないなどの限界があり, それを乗り越えるために一分子蛍光強度と新たに空間相互相関測定を利用してこれまでの研究をさらに発展させていくことを計画した。そのためにまず走査型2点測定FCS装置の試作と細胞内相互作用測定法を確立した。次に具体的なターゲットとしてGlucocorticoid Receptor(GR)に注目した。我々のこれまでのFCS測定の結果、核内でGRが二量体化することで転写調節が開始されるという機構を示唆しているが、細胞のどこで(空間)、何時(時間)2量化するかは不明のままである。その解明のため、まずFCS時間相関解析における蛍光寿命解析による2量体補正を完成させることを目指した。これまでさまざまなリンカー長を有する約20種類のGFP2量体を作成し, その長さとFCSにおける一分子蛍光強度との関係を明らかにした。リンカー長が短くなるとホモFRETがおきるために蛍光寿命が短くなり, それに伴い蛍光強度も小さくなり, FCSにおける一分子あたりの蛍光強度も低下した。しかし, ある長さ以下の組み合わせでは蛍光強度が回復するところがあり, そのリンカー配列以降で構造変化が示唆され, その部分までがFCSにおける2量体測定の定量的な測定が可能であることが分かった。今後, FCSの一分子蛍光強度を指標にして細胞質ならびに核内におけるGR2量体形成量の詳細な解析を目指す予定である。

我们相信，可视化感兴趣的生物分子与活细胞内其他生物分子之间相互作用的强度将与可视化动态生物功能直接相关。因此，我们利用荧光相关光谱（FCS）来分析细胞核内部的结构，重点关注分子运动的特征，发现传统成像方法无法阐明的与核功能的密切关系。一个动态机制然而，仅基于扩散测量的FCS存在局限性，例如除非分子量比极大，否则无法检测分子之间的相互作用，并且不能忽视内源蛋白质的影响，我们计划进一步发展我们之前的研究。使用荧光强度和新的空间互相关测量。为此，我们首先制造了原型扫描两点FCS装置，并建立了测量细胞内相互作用的方法。接下来，我们将糖皮质激素受体（GR）作为具体靶点。我们之前的 FCS 测量表明转录调控是由细胞核中 GR 二聚化启动的机制，但二聚化是否在细胞中发生（空间）和何时（时间）仍不清楚？为了阐明这一点，我们首先旨在使用 FCS 时间相关分析中的荧光寿命分析来完成二聚体校正。到目前为止，我们已经创建了约20种不同接头长度的GFP二聚体，并在FCS中阐明了长度与单分子荧光强度之间的关系。随着接头长度变短，同源FRET导致的荧光寿命变短，荧光强度也降低，FCS中每个分子的荧光强度也降低。然而，在低于一定长度的一些组合中，荧光强度恢复，表明接头序列后发生结构变化，并且已经发现FCS中的定量二聚体测量可以达到该部分。未来，我们计划以FCS单分子荧光强度为指标，对细胞质和细胞核中GR二聚体形成量进行详细分析。

项目成果

Cross-talk-free fluorescence cross-correlation spectroscopy by the switching method

采用切换法的无串扰荧光互相关光谱

• 发表时间: 2008
• 期刊: Cell Struct Funct 33(1)
• 作者: Takahashi Y;Nishimura J;Suzuki A;Ishibashi K;Kinjo M;Miyawaki A
• 通讯作者: Miyawaki A

FCSによる解析法

使用FCS的分析方法

• 发表时间: 2007
• 期刊: 別冊「分子間相互相互作用解析ハンドブック」
• 作者: Jin T;Fujii F;Yamada E;Nodasaka Y;Kinjo M.;Shintaro Mikuni;Masafumi Shimizu;Kabayama K;Takahashi Y;Fujii F;Jin T;Pieper T;Fujii F;金城政孝;金城政孝;三國新太郎
• 通讯作者: 三國新太郎

Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy of Plant Proteins

• DOI: 10.1007/978-1-59745-289-2_13
• 发表时间: 2009-01-01
• 作者: Muto, Hideki;Kinjo, Masataka;Yamamoto, Kotaro I.
• 通讯作者: Yamamoto, Kotaro I.

Detection of polyglutamine protein oligomers in cells by fluorescence correlation spectroscopy.

通过荧光相关光谱法检测细胞中的聚谷氨酰胺蛋白寡聚物。

• 发表时间: 2007
• 期刊: J Biol Chem 282
• 作者: Takahashi Y;Okamoto Y;Popiel HA;Fujikake N;Toda T;Kinjo M;Nagai Y.
• 通讯作者: Nagai Y.

Stress-induced environmental changes in a single cell as revealed by fluorescence lifetime imaging

• DOI: 10.1039/b805032e
• 发表时间: 2008-01-01
• 期刊: PHOTOCHEMICAL & PHOTOBIOLOGICAL SCIENCES
• 影响因子: 3.1
• 作者: Nakabayashi, Takakazu;Nagao, Issei;Ohta, Nobuhiro
• 通讯作者: Ohta, Nobuhiro