組換え体を用いた軸糸外腕ダイニン運動機構の解明

使用重组细胞阐明轴丝臂外动力蛋白运动机制

• 批准号: 19037008
• 负责人: 豊島 陽子
• 金额: $ 3.26万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19037008/
• 关键词: 分子モーター; ナノバイオ; 1分子計測; 光ピンセット; 分子機械

平成19年度までに、テトラヒメナの発現系を用いて、3頭構造をもつ軸糸外腕ダイニンのそれぞれの頭部のC末端側にタグを挿入して蛍光標識を行い、それらが微小管上を連続的に動くことを観察してきたが、本年度は3つの頭部の動きを詳細に解析し、複数頭部のあいだの運動の協調性を見ることを目的に実験を行った。ダイニン頭部の可視化のためのプローブとして安定した蛍光をもつQdotを利用しているが、シグナルのノイズが大きく、その原因としてレールとなる微小管の種類や、微小管のガラス上への固定法が不十分であることが考えられる。そこでレールとしてテトラヒメナの軸糸を使用したところ、ややノイズが減る傾向があることがわかった。しかし、ナノメートルレベルの解析には十分ではなかったため、ガラスへの固定法として、(1)アゾポリマーで処理したガラス意表面上に光照射で軸糸の固定を行ったところ、改善が見られた。また、(2)ガラス表面をシラン化して共有結合あるいはキネシンミュータントを利用して微小管を固定する方法を検討中である。さらにまた、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡による観察像からその輝点の重心を自動的に求めるためのプログラムを開発し、自動追跡により大量のデータを効率よく処理することが可能となった。テトラヒメナの発現系を使ったダイニンの構築としては、ダイニン尾部のN末端や、尾部の頭部よりの位置にタグを導入し、蛍光標識をすること及びそれらの運動性を確認した。

到2007财年，我们利用四膜虫的表达系统，在三头外轴臂动力蛋白的每个头的C末端插入了一个标签，并对其进行了荧光标记，这些标签被用来标记微管。一直在观察连续运动，但今年我们进行了一项实验，目的是详细分析三个头部的运动并检查多个头部之间运动的协调性。使用具有稳定荧光的 Qdot 作为探针来可视化动力蛋白头，但信号有噪声，其原因是用作轨道的微管类型以及将微管固定在玻璃上的方法。这可能是不够的。当使用四膜虫轴丝作为导轨时，发现噪音有稍微降低的趋势。然而，这对于纳米水平的分析来说是不够的，因此作为将轴丝固定到玻璃上的方法，(1)我们通过光照射将轴丝固定在用偶氮聚合物处理的玻璃表面上，并且看到了改进。此外，我们目前正在研究（2）硅烷化玻璃表面以使用共价键或驱动蛋白突变体固定微管的方法。此外，我们开发了一种程序，可以根据使用全内反射荧光（TIRF）显微镜观察到的图像自动确定亮点的重心，从而可以通过自动跟踪有效地处理大量数据。为了使用四膜虫表达系统构建动力蛋白，我们在动力蛋白尾部的N末端或靠近尾部头部的位置引入标签，对它们进行荧光标记，并确认它们的运动性。

项目成果

Minus-end-directed motor ncd exhibits processive movement that is enhanced by microtubule bundling in vitro

• DOI: 10.1016/j.cub.2007.12.056
• 发表时间: 2008-01-22
• 期刊: CURRENT BIOLOGY
• 影响因子: 9.2
• 作者: Furuta, Ken'ya;Toyoshima, Yoko Yano
• 通讯作者: Toyoshima, Yoko Yano

NDEL1 phosphorylation by aurora-A kinase is essential for centrosomal maturation, separation, and TACC3 recruitment

• DOI: 10.1128/mcb.00878-06
• 发表时间: 2007-01-01
• 期刊: MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY
• 影响因子: 5.3
• 作者: Mori, Daisuke;Yano, Yoshihisa;Hirotsune, Shinji
• 通讯作者: Hirotsune, Shinji

Direction and Speed of Microtubule Movements Driven by Kinesin Motors Arranged on Catchin Thick Filaments

布置在 Catchin 粗丝上的驱动蛋白马达驱动微管运动的方向和速度

• 发表时间: 2008
• 期刊: Journal of Muscle and Cell Motility 65
• 作者: Toshiki Taba;Masaki Edamatsu;Shiori Toba;Keitaro Shibata;Yasuhiro Imafuku;Yoko Yano Toyoshima;Katsuhisa Tawada;Akira Yamada
• 通讯作者: Akira Yamada

Mmus-end-directed motor Ncd exhibits processive movement that is enhanced by microtubule bundling in vitro

Mmus 末端定向运动 Ncd 表现出通过体外微管捆绑增强的进行性运动

• 发表时间: 2008
• 期刊: Current Biology 18
• 作者: Furuta;K. and Toyoshima;Y.Y.
• 通讯作者: Y.Y.

Diffusion and directed movement : In vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkll

扩散和定向运动：裂殖酵母驱动蛋白 14 Pkll 的体外运动特性

• 发表时间: 2008
• 期刊: J. Biol.Chem 2835
• 作者: Furuta;K. and Toyoshima;Y.Y.
• 通讯作者: Y.Y.