発光性人工蛋白質の開発と生体シグナル解析への応用

发光人工蛋白的开发及其在生物信号分析中的应用

基本信息

批准号：
19021041
负责人：
石田斉
金额：
$ 2.94万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究代表者は、ビピリジン骨格を有する非天然アミノ酸として5'-アミノ-2, 2'-ビピリジンー5-カルボン酸を3残基導入したペプチドをルテニウム錯体化することによって、一定の折り畳み構造をもつ発光性人工蛋白質の開発を行っており、Peptide Origami(ペプチド折り紙)と名付けられている。これまでに、折り畳み構造の異なる複数の異性体が得られ、それらを少量分離精製した後、細胞内導入挙動を検討してきたが、平成20年度は、これまで明らかにされていなかった折り畳み構造を解明する目的から、各異性体をミリグラム(mg)スケールで分離精製し、その二次元NMR測定を行うことにより、それぞれの折り畳み構造を決定することに成功した。また、これまでの研究から、このペプチド錯体はコア部分にルテニウムトリス(ビピリジン)型錯体を有するため、溶液中、室温条件下においても、励起三重項からのりん光発光が観測され、りん光発光は長寿命かつ大きなストークスシフトを示すことから、細胞内においてもバックグラウンド発光を抑えた発光挙動が観測されている。今年度は、細胞内導入機構を明らかとする目的から、経時変化ならびに低温での細胞内導入を検討した。その結果、低温条件下ではほとんど細胞内へ取り込まれないことが明らかとなり、エンドサイトーシス機構により取り込まれることが示唆された。一方、無置換体であるルテニウムトリス(ビピリジン)錯体も同様の細胞内導入挙動を示したが、低温条件下においても取り込まれたことから、取り込み機構が異なることが示唆された。本人工タンパク質はペプチド配列を容易に変えられることから、今後は目的に応じた分子設計を行い、細胞内導入ならびに細胞内における機能発現を検討する予定である。

主要研究人员通过与钌络合，开发出一种具有一定折叠结构的肽，其中引入了5'-氨基-2,2'-联吡啶-5-羧酸的三个残基作为具有联吡啶骨架的非天然氨基酸我们正在开发一种发光的人造蛋白质，名为“肽折纸”。到目前为止，我们已经获得了多种具有不同折叠结构的异构体，并分离和纯化了少量它们，然后研究了它们进入细胞的行为。为了阐明这一点，他们在毫克（mg）规模上分离和纯化了每种异构体。，并通过进行二维核磁共振测量，成功确定了每个的折叠结构。此外，根据之前的研究，由于该肽复合物的核心部分具有钌三(联吡啶)型复合物，因此即使在溶液中和室温下也可以观察到激发三重态的磷光，因为它具有长寿命和大斯托克斯。即使在细胞内部也观察到背景发光受到抑制的发光行为。今年，为了阐明细胞内导入的机制，我们研究了随时间的变化和低温下的细胞内导入。结果表明，在低温条件下，它几乎不被细胞摄取，表明它是通过内吞机制摄取的。另一方面，未取代的钌三联吡啶络合物表现出类似的细胞内引入行为，但也在低温条件下被摄取，表明摄取机制不同。由于这种人工蛋白质的肽序列可以很容易地改变，因此我们计划根据目的设计该分子，并检查其进入细胞的情况以及其在细胞内功能的表达。