テロメアによる染色体維持機構の解明

端粒对染色体维持机制的阐明

基本信息

批准号：
18058010
负责人：
加納純子
金额：
$ 2.82万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18058010/
关键词：
染色体テロメア Rapl Pot1 分裂酵母 DNA複製チェックポイント

项目摘要

真核生物の染色体末端には、テロメアという構造が存在し、様々な重要な役割を果たしている。テロメア繰り返し配列からなるテロメアDNAは、最末端の一本鎖部分とその内側の二重鎖部分からなる。分裂酵母の一本鎖テロメアDNAには、Pot1タンパク質が結合し、二重鎖テロメアDNAにはTaz1タンパク質が直接結合することが知られている。これまでに我々は、Rap1がTaz1に結合することによってテロメアにリクルートされ、テロメアDNA長を負に制御することを明らかにした。Rap1の分子機能を具体的に明らかにするため、Rap1と相互作用する因子を同定することを試みた。まず、Rap1を細胞抽出液から免疫沈降し、その沈降物に含まれるタンパク質を質量分析により調べた。Rap1に特異的に相互作用する因子として、Pot1, Tpz1, Poz1, Ccq1, Taz1などを同定した。免疫沈降実験およびtwo-hybrid assayにより、Pot1にTpz1が結合し、さらにTpz1にPoz1およびCcq1が結合することがわかった。さらに、Rap1はPoz1と直接結合することがわかった。様々な解析により、Taz1-Rap1-Poz1-Tpz1-Pot1という複合体が形成されている時には(二重鎖テロメアDNAが十分長い時)、テロメラーゼのテロメアへの作用が負に制御され、テロメアDNAはそれ以上伸びないようになり、上記の複合体が形成されない時には(二重鎖テロメアDNAが短い時)、Ccq1の働きによってテロメラーゼがテロメアに作用し、テロメアDNAが伸びると考えられた。

端粒存在于真核染色体的末端，发挥着多种重要作用。端粒DNA由端粒重复序列组成，由最末端的单链部分和该单链部分内部的双链部分组成。已知Pot1蛋白在裂殖酵母中与单链端粒DNA结合，而Taz1蛋白直接与双链端粒DNA结合。我们之前已经表明，Rap1 通过与 Taz1 结合而被招募到端粒，并对端粒 DNA 长度进行负调节。为了具体阐明 Rap1 的分子功能，我们尝试鉴定与 Rap1 相互作用的因子。首先，从细胞提取物中免疫沉淀Rap1，并通过质谱法检查沉淀物中所含的蛋白质。 Pot1、Tpz1、Poz1、Ccq1 和 Taz1 被确定为与 Rap1 特异性相互作用的因子。免疫沉淀实验和双杂交实验表明，Tpz1 与 Pot1 结合，Poz1 和 Ccq1 与 Tpz1 结合。此外，发现 Rap1 直接与 Poz1 结合。各种分析表明，当复合物Taz1-Rap1-Poz1-Tpz1-Pot1形成时（当双链端粒DNA足够长时），端粒酶对端粒的作用受到负调控，端粒当DNA不再伸长且不形成上述复合体时（双链端粒DNA较短），端粒酶通过Ccq1的作用作用于端粒，端粒DNA被认为被伸长。