鉄ニッケル型ヒドロゲナーゼの金属クラスター形成における構造生物学的研究

铁镍氢化酶金属簇形成的结构生物学研究

• 批准号: 18054029
• 负责人: 庄村 康人
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: University of Hyogo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18054029/
• 关键词: [NiFe]ヒドロゲナーゼ; 金属クラスター形成; X線結晶構造解析; カルバモイル基転移; [NiFe]ヒドロゲナーゼ; 金属クラスター形成; X線結晶構造解析; カルバモイル基転移

本研究では水素分子の酸化を可逆的に触媒するヒドロゲナーゼのNiFeクラスター活性中心形成過程に関与する,HypEとHypFが触媒するカルバモイルリン酸からニトリル基を合成する反応機構の解明を目指している.昨年度までは,硫酸還元菌Desulfovibrio vulgaris Hildenborough由来のタンパク質試料を用いて実験を行い,ヌクレオチド結合型,非結合型それぞれにおいてHypE単体の結晶構造決定に成功していたが,活性のあるHypFタンパク質試料の調整が困難であることが判明していた.そこで今年度は,大腸菌由来HypE,HypFタンパク質の調整を試みた.アフィニティークロマトグラフィー等による精製後のタンパク質は硫酸還元菌由来のものとは異なり,両者の間には有意な相互作用が見られ,さらにHypFによるHypEへのカルバモイル化反応も確認できた.HypEF複合体をゲルろ過カラムクロマトグラフィー等の手法により分析したところ,(HypE)_2(HypF)_2の量比を示唆する結果が得られ,高純度の複合体試料を得ることに成功している.また,全長HypF単体の結晶化は困難であることがこれまでに分かっているため,結晶化に適したコンストラクト作製にも着手しており,その結果,幾つかの有力な発現系が得られた.これらの発現系は,結晶化だけでなく,HypEとHypFの相互作用様式および反応機構の解明にも大いに役立つことが期待される.

这项研究旨在阐明从炒作和HYPF催化的甲磷酸甲磷酸二氮基团的反应机制，这些磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸盐和催眠酶催化的碳氧化酶的氢化酶的氢化酶的活性中心形成过程可逆地催化氢分子的氧化。直到去年，我们使用源自希尔登伯勒（Hildenborough）的蛋白质样品进行了实验，但我们进行了实验，尽管仅靠核苷酸结合和未结合的类型成功地确定了单独的HYPE晶体结构，但发现很难调节活性催眠蛋白样品。因此，今年我们试图从大肠杆菌调整炒作和催眠蛋白。亲和色谱和其他因素纯化后的蛋白质与从硫酸盐还原细菌中得出的蛋白质不同，并且它们之间存在显着的相互作用，并且还证实了由HYPF对炒作的碳酰胺化反应。通过凝胶过滤柱色谱和其他方法分析了hypef复合物，结果表明（HYPE）_2（HYPF）_2的量比，并能够获得高纯度复合物样品。此外，由于迄今为止众所周知，仅全长炒作的结晶就很困难，因此我们还开始创建适合结晶的构造，因此，已经获得了几种有希望的表达系统。这些表达系统不仅在结晶中非常有用，而且在阐明炒作和催眠的相互作用模式和反应机制方面也非常有用。