細胞膜・核膜の切開、平面展開技術の確立と細胞膜・核膜機能の解明

细胞膜/核膜切口的建立、平面显影技术、细胞膜/核膜功能的阐明

• 批准号: 18048029
• 负责人: 小此木 孝仁
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18048029/
• 关键词: フェムト秒レーザ; 細胞膜-核膜切開技術; 平面状生体膜; 傾斜リソグラフィー; 微小流体回路; 微小吸引孔; 核-細胞質間輸送; 蛍光顕微鏡観察; キャビテーション; 細胞膜の切開; 細胞膜の平面展開; 細胞膜内側構造の開放; 細胞膜アレイ; ガンマーカーの検出; 単一細胞からのミトコンドリア

前年度の研究で得られたフェムト秒レーザによる細胞膜-核膜切開技術を用いて展開された生体膜が生理活性を有するか実証するために、細胞核を切開し基板上に固定した平面状核膜が機能を有しているか、その核膜が持つ核膜孔複合体による核-細胞間輸送を観察することで評価した。始めに、微小流体回路を構築するにあたって当研究チームの鈴木孝明が有するsingle-MASK傾斜リソグラフィー技術により複雑な流体回路を簡便に構築し、その回路内にある微小な吸引孔を用いて細胞核の把持しフェムト秒レーザを照射し核膜の加工を行った。この微小流体回路は下記の2つの特徴を持つ。(1)吸引孔が流体回路装置の水平面に対し垂直に配置されており、把持された平面状核膜を顕微鏡視野面に対して垂直に配置することで、核膜孔複合体での物質通過をより詳細に観察できる。(2)吸引孔が2つの流路を跨ぐように配置されており、吸引孔に固定した核膜のそれぞれの面(細胞質側と核質側)に個別に試薬を与えることができるため、細胞質から核側への輸送ならびに核から細胞質側への輸送を、厳密に溶液組成をコントロールした条件化で観察することができる。次に平面状に展開した核膜が核-細胞間輸送活性を有しているか、その輸送通過における分子サイズに依存した篩い機能を有しているか、低分子(蛍光グルコース、分子量500程度)と高分子(蛍光標識抗体、分子量150,000程度)を与えた時に低分子を選択的に通すか蛍光顕微鏡観察により確認した。その結果、平面状に展開した核膜において選択的に低分子の通過が起きることを確認することができた。以上まとめると、(1)密閉された微小流体回路内でフェムト秒レーザを用いることで核膜を平面状に展開し、(2)その回路の特徴を利用した平面核膜へ表裏への自由な薬剤投下を行い、(3)その核膜が有する核膜孔複合体の生理活性を測定することに成功した。

为了证明利用前一年研究中获得的基于飞秒激光的细胞膜-核膜切割技术开发的生物膜是否具有生理活性，通过解剖细胞核并将其固定在基底上来制备平面核膜。通过观察核细胞通过核膜核孔复合体的转运来评估核膜的功能。首先，为了构建微流体回路，我们利用我们研究团队的Takaaki Suzuki拥有的单掩模倾斜光刻技术轻松构建了复杂的流体回路，然后利用回路中的微小吸孔抓取了细胞核。通过飞秒激光照射加工而成。该微流体回路具有以下两个特征。 (1)抽吸孔垂直于流体回路装置的水平面布置，并且通过将所夹持的平面核膜垂直于显微镜的观察面放置，可以观察到能够穿过核膜孔复合体的物质。更多细节。 (2)吸引孔被布置成横跨两个通道，并且可以将试剂单独地施加到固定到吸引孔的核膜的每一侧(细胞质侧和核质侧)，从细胞核输送到细胞质。可以在严格控制溶液组成的条件下观察。接下来，我们将检查以平面方式发育的核膜是否具有核细胞转运活性，以及​​其转运过程中是否具有依赖于分子大小的筛分功能，通过荧光显微镜观察来确认是否较低。当应用聚合物（荧光标记抗体，分子量约为 150,000）时，分子会选择性地通过。结果，我们能够确认低分子选择性地通过平面核膜。综上所述，（1）在密封的微流控回路中使用飞秒激光将核膜发展成平面形状，（2）利用该回路的特性可以使核膜从前到后自由扩展。成功注射药物并（3）测量核膜中核孔复合物的生理活性。

项目成果

境界膜展開方法、境界膜展開装置、境界膜展開体

限位膜展开方法、限位膜展开装置、限位膜展开体

• 发表时间: 2006

Proposal and design of an on-chip organelle selection : Ablation of cell structures with femtosecond laser

片上细胞器选择的提议和设计：用飞秒激光烧蚀细胞结构

• 发表时间: 2006
• 期刊: Proc.IEEE Robotics and Automation Soc.MHS2006
• 作者: A.Okonogi;M.Takeuchi;T.Suzuki;H.Kotera;H.
• 通讯作者: H.