ゲノムDNA単分子解析と細胞サイズベシクル中での生化学実験

细胞大小囊泡中的基因组 DNA 单分子分析和生化实验

基本信息

批准号：
18048007
负责人：
小穴英廣
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18048007/
关键词：
ゲノムDNA オプティカルマッピング光ピンセット PNA 三重鎖(triplex)

项目摘要

本研究では、一つの細胞からDNAを切断することなく取り出し、顕微鏡下でオプテイカルマッピングを行い、探索したい塩基配列の有無、存在する場合はどの位置にあるかを迅速に明らかにするという解析手法の確立を目指している。具体的には超好熱始原菌をもちいて本手法の有用性を示すと共に超好熱始原菌研究に有用な情報を提供する事を目指している。本年度は、超好熱始原菌KOD1株のゲノムDNA(全長約680um)に対し、断片化させることなく単分子オプティカルマッピングを行うことを目指し、研究を進めた。KOD1ゲノムDNAを浸透圧ショックによる細胞破壊で取り出した後、蛍光標識オリゴPNAプローブを導入して複製開始領域の特定塩基配列部とPNAとで三重鎖を形成させ、ゲノムDNA分子を光ピンセットで伸展させてオプティカルマッピングを行った。オリゴPNAプローブは、KOD1ゲノムDNAの複製開始領域を認識するようにデザインし、蛍光標識にはQdot用いた。前年度、一部伸展されたDNAの鎖上にQdotの輝点を確認する事に成功していたが、蛍光プローブの非特異吸着の問題が認められていた。本年度は実験プロトコルを改良し、非特異吸着を押さえつつ、十分な量の解析サンプルを得ることに成功した。

在这项研究中，我们使用一种分析方法，从单个细胞中提取DNA而不切割它，在显微镜下进行光学映射，并快速揭示我们想要搜索的碱基序列是否存在，如果存在，它在哪里我们的目标是建立这个。具体来说，我们的目标是利用超嗜热古菌来证明该方法的有用性，并为超嗜热古菌研究提供有用的信息。今年，我们进行了研究，目的是对超嗜热古菌KOD1菌株的基因组DNA（全长约680微米）进行单分子光学测绘，而不对其进行片段化。通过渗透压冲击破坏细胞提取KOD1基因组DNA后，引入荧光标记的寡聚PNA探针，在复制起始区的特定碱基序列和PNA之间形成三链体，然后使用光镊拉伸基因组DNA分子。，进行光学测绘。寡聚 PNA 探针设计用于识别 KOD1 基因组 DNA 的复制起始区，并使用 Qdot 进行荧光标记。去年，我们成功确认了部分延伸的DNA链上的Qdot亮点，但发现了荧光探针非特异性吸附的问题。今年，我们改进了实验方案，成功获得了足够量的分析样品，同时抑制了非特异性吸附。