ゲノムDNA単分子解析と細胞サイズベシクル中での生化学実験

细胞大小囊泡中的基因组 DNA 单分子分析和生化实验

基本信息

批准号：
18048007
负责人：
小穴英廣
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18048007/
关键词：
ゲノムDNA オプティカルマッピング光ピンセット PNA 三重鎖(triplex)

项目摘要

本研究では、一つの細胞からDNAを切断することなく取り出し、顕微鏡下でオプテイカルマッピングを行い、探索したい塩基配列の有無、存在する場合はどの位置にあるかを迅速に明らかにするという解析手法の確立を目指している。具体的には超好熱始原菌をもちいて本手法の有用性を示すと共に超好熱始原菌研究に有用な情報を提供する事を目指している。本年度は、超好熱始原菌KOD1株のゲノムDNA(全長約680um)に対し、断片化させることなく単分子オプティカルマッピングを行うことを目指し、研究を進めた。KOD1ゲノムDNAを浸透圧ショックによる細胞破壊で取り出した後、蛍光標識オリゴPNAプローブを導入して複製開始領域の特定塩基配列部とPNAとで三重鎖を形成させ、ゲノムDNA分子を光ピンセットで伸展させてオプティカルマッピングを行った。オリゴPNAプローブは、KOD1ゲノムDNAの複製開始領域を認識するようにデザインし、蛍光標識にはQdot用いた。前年度、一部伸展されたDNAの鎖上にQdotの輝点を確認する事に成功していたが、蛍光プローブの非特異吸着の問題が認められていた。本年度は実験プロトコルを改良し、非特異吸着を押さえつつ、十分な量の解析サンプルを得ることに成功した。

这项研究旨在建立一种分析方法，其中从单个单元中提取DNA而不分裂，在显微镜下执行Opticar映射，并迅速揭示您是否要搜索的基本序列以及在哪里，如果是这样。具体而言，目的是使用高含量原始细菌来证明该方法的有用性，并为研究过度疗法的原始细菌提供有用的信息。今年，我们进行了研究，目的是对高疗原始后代菌株KOD1的基因组DNA（总长度约为680 um）进行单分子光学映射，而不会碎裂。在通过渗透性休克通过细胞破坏去除KOD1基因组DNA后，引入了荧光标记的寡-PNA探针，以在复制起始区和PNA的特定碱基序列部分和PNA之间形成三胞胎，并用基因组DNA分子通过光学的Tweeezer进行光学映射，以进行光学映射。寡-PNA探针设计为识别KOD1基因组DNA的复制起始区域，并用于荧光标记。在上一年，在部分扩展的DNA的链上成功证实了QDOT亮点，但是观察到荧光探针的非特异性吸附的问题。今年，我们改善了实验方案，并成功获得了足够数量的分析样本，同时将非特异性吸附到位。