全mRNAカウンティングの基盤技術開発

总mRNA计数基础技术开发

• 批准号: 18038010
• 负责人: 紀藤 圭治
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18038010/
• 关键词: GATC-PCR法; 絶対定量; トランスクリプトーム

1、RNA抽出法の検討(1)、抽出法の比較検討RNA抽出に関する様々な方法論の比較検討を行った。難度の高い酵母からのRNA抽出の為にこれまでに開発された方法6種類を取り上げて、同一サンプルからのRNA回収を行い、収量の検討を実施した。抽出法によりRNA回収量に10倍以上の差が有り、そのなかで、長時間65℃で放置するホットフェノール法が最も高い回収率を示した。2、GATC-PCRの反応効率モニター系の開発(1)各ステップの反応効率のモニター試験管内転写により合成した既知量のIVT-RNAとdsDNAを鋳型RNAサンプルに加えた。ここで、これら2種の標準は内部断片に鎖長の多型を持たせておき、競合PCRによる識別定量が可能なように設計した。この標準分子により、GATC-PCRにおける各反応の効率をモニターした。第2鎖合成と制限酵素消化を合わせた効率は95%であり、アダプターDNA付加効率は66%であった。GATC-PCRの反応効率をステップに分けてモニターすることが可能となり、反応条件の最適化ならびに絶対定量値の算出に有用な系を開発することができた。(2)、内部標準による絶対定量値の算出2種類の内在性mRNAに対し、それぞれ同一配列の一部に鎖長の多型を有するRNAを試験管内転写により合成し、鋳型RNAサンプルに加えた。既知量のIVT-RNAは、内在性mRNAに対する内部標準となり、GATC-PCRとは独立してこれら2種類のmRNAの絶対量を算出した。得られた絶対量により、GATC-PCRによるトランスクリプトームの絶対定量値を補正することで、同一サンプル内でのGATC-PCRによる絶対定量値について、高い再現性が得られた。即ち、本内部標準によりGATC-PCRの反応効率全体を補正し、正確な絶対定量値が算出可能となった。

1. RNA提取方法的检验 (1)、提取方法的比较检验 我们对RNA提取的各种方法进行了比较检验。使用之前开发的六种从酵母中提取 RNA 的高难度方法，我们从同一样品中回收了 RNA 并检查了产量。根据提取方法的不同，RNA的回收量存在10倍以上的差异，其中，将RNA长时间放置在65℃的热苯酚法的回收率最高。 2. GATC-PCR 反应效率监测系统的开发 (1) 监测各步骤的反应效率 将体外转录合成的已知量的 IVT-RNA 和 dsDNA 添加到模板 RNA 样品中。在这里，这两种类型的标准品被设计为在其内部片段中具有链长多态性，以便能够通过竞争性 PCR 进行差异定量。该标准分子用于监测 GATC-PCR 中每个反应的效率。第二链合成和限制性酶消化的组合效率为95%，接头DNA添加效率为66%。可以逐步监控 GATC-PCR 的反应效率，并且我们能够开发出可用于优化反应条件和计算绝对定量值的系统。 (2)使用内标计算绝对定量值通过体外转录合成两种类型的内源mRNA，在相同序列的部分中具有链长多态性的RNA，并添加到模板RNA样品中。已知量的IVT-RNA作为内源mRNA的内标，并且独立于GATC-PCR计算这两类mRNA的绝对量。通过使用获得的绝对量校正GATC-PCR的转录组的绝对定量值，同一样品内的GATC-PCR的绝对定量值获得了高再现性。即，该内标校正了GATC-PCR的整体反应效率，从而可以计算出准确的绝对定量值。