脱分極がCa2+流入に依存せずに伝達物質放出を増強する機序とその生理的意義の解明

阐明去极化增强递质释放而不依赖于 Ca2+ 内流的机制及其生理意义

基本信息

批准号：
18021027
负责人：
石橋仁
金额：
$ 4.03万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞外Ca^<2+>に依存しない新たな神経伝達物質放出機構の詳細なメカニズムの解明を目指し、本研究を行った。神経終末部が付着した状態で単離した脊髄神経細胞にパッチクランプ法を適用し、細胞外Ca^<2+>-free条件下、高K^+溶液により神経終末部の脱分極刺激を行うと、グリシン作動性IPSCの頻度が著明に増加した。今回、高濃度のwortmannin等、イノシトール代謝に影響を与える薬物を用いることにより、この応答にPLCの基質であるPIP2の生合成が必要であることがわかった。また、海馬CA3領域より単離した神経細胞においても、高K^+溶液によりGABA作動性IPSCの頻度が増加した。この海馬における応答は、スライス標本を用いても観察されてことから、急性単離した細胞に特徴的なものではないことがわかった。一方、スライス標本を用いた解析では、溶液灌流速度が遅くCa^<2+>-free条件から正常な条件に戻すのに時間がかかり、evoked IPSCに対する細胞外Ca^<2+>-free条件下での脱分極の影響を解析することが困難であった。従って、培養細胞を用いて更なるメカニズムの解明を試みた。細胞外をCa^<2+>-free条件にすると、evoked IPSCは完全に抑制された。この細胞外Ca^<2+>-free条件下に50Hzで1分間の高頻度刺激を行った後、急速に細胞外を正常な溶液に戻すと、約50%の細胞でevoked IPSCの振幅が刺激前よりも増強された。この応答は、EGTA-AMの前処置によって完全に抑制された。従って、高K^+による脱分極刺激だけでなく、電気刺激による高頻度刺激によっても、神経終末部で細胞外Ca^<2+>に依存せずに終末部内Ca^<2+>濃度が上昇することがわかった。以上の結果から神経伝達物質放出を制御する新たなメカニズムの解明に繋がると考えられた。

进行这项研究的目的是阐明与细胞外Ca^<2+>无关的新神经递质释放机制的详细机制。当将斑块夹法应用于与附着的神经末端分离的脊髓神经细胞，并在高k^+溶液下进行了细胞外Ca^<2+> - 自由条件下进行去极化的神经末端时，甘氨酸IPSC的频率显着增加。在本文中，我们发现，通过使用影响肌醇代谢的药物，例如高浓度，有必要使用PIP2的生物合成（PIP2（PLC）的底物（用于PLC）进行这种反应。此外，在从海马CA3区分离的神经元中，由于高k^+溶液，GABA能IPSC的频率增加。还使用切片标本观察到海马中的这种反应，表明它不是急性分离的细胞的特征。另一方面，使用切片标本的分析表明，溶液灌注速率很慢，并且花了很长时间才从CA^<2+> - 自由条件返回正常条件，从而难以分析细胞外CA^<2+>下的去极化对诱发IPSC的自由条件。因此，尝试使用培养细胞阐明进一步的机制。细胞外放置在Ca^<2+> - 自由条件中完全抑制了诱发的IPSC。在细胞外Ca^<2+> - 自由条件下，在50 Hz处的高频刺激1分钟后，细胞外刺激迅速恢复到正常溶液中，并且在大约50％的细胞中，诱发的IPSC的振幅比刺激之前大约50％增加。 EGTA-AM预处理完全抑制了这种反应。因此，发现在神经末端的内膜Ca^<2+>浓度在神经末端的细胞外Ca^<2+>而不依赖于神经末端的细胞外Ca^<2+>，这不仅是由于高k^+引起的去极化刺激，而且还因为电刺激而引起的高频刺激。以上结果表明，这将导致阐明用于控制神经递质释放的新机制。