脱分極がCa2+流入に依存せずに伝達物質放出を増強する機序とその生理的意義の解明

阐明去极化增强递质释放而不依赖于 Ca2+ 内流的机制及其生理意义

基本信息

批准号：
18021027
负责人：
石橋仁
金额：
$ 4.03万
依托单位：
National Institute for Physiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞外Ca^<2+>に依存しない新たな神経伝達物質放出機構の詳細なメカニズムの解明を目指し、本研究を行った。神経終末部が付着した状態で単離した脊髄神経細胞にパッチクランプ法を適用し、細胞外Ca^<2+>-free条件下、高K^+溶液により神経終末部の脱分極刺激を行うと、グリシン作動性IPSCの頻度が著明に増加した。今回、高濃度のwortmannin等、イノシトール代謝に影響を与える薬物を用いることにより、この応答にPLCの基質であるPIP2の生合成が必要であることがわかった。また、海馬CA3領域より単離した神経細胞においても、高K^+溶液によりGABA作動性IPSCの頻度が増加した。この海馬における応答は、スライス標本を用いても観察されてことから、急性単離した細胞に特徴的なものではないことがわかった。一方、スライス標本を用いた解析では、溶液灌流速度が遅くCa^<2+>-free条件から正常な条件に戻すのに時間がかかり、evoked IPSCに対する細胞外Ca^<2+>-free条件下での脱分極の影響を解析することが困難であった。従って、培養細胞を用いて更なるメカニズムの解明を試みた。細胞外をCa^<2+>-free条件にすると、evoked IPSCは完全に抑制された。この細胞外Ca^<2+>-free条件下に50Hzで1分間の高頻度刺激を行った後、急速に細胞外を正常な溶液に戻すと、約50%の細胞でevoked IPSCの振幅が刺激前よりも増強された。この応答は、EGTA-AMの前処置によって完全に抑制された。従って、高K^+による脱分極刺激だけでなく、電気刺激による高頻度刺激によっても、神経終末部で細胞外Ca^<2+>に依存せずに終末部内Ca^<2+>濃度が上昇することがわかった。以上の結果から神経伝達物質放出を制御する新たなメカニズムの解明に繋がると考えられた。

我们进行这项研究的目的是阐明一种不依赖于细胞外Ca^2+的新神经递质释放机制的详细机制。采用膜片钳法分离附有神经末梢的脊神经细胞，在无细胞外Ca^2+的条件下用高K^+溶液去极化神经末梢，甘氨酸IPSCs的频率明显增加。通过使用影响肌醇代谢的高浓度药物（例如渥曼青霉素），我们发现这种反应需要 PIP2（PLC 的底物）的生物合成。此外，高 K^+ 溶液还增加了从海马 CA3 区分离的神经元中 GABA 能 IPSC 的频率。使用切片制剂也观察到海马体中的这种反应，表明它不是急性分离细胞的特征。另一方面，在使用切片制剂的分析中，溶液灌注速率慢，并且从无Ca^2+条件恢复到正常条件需要时间，并且细胞外无Ca^2+条件引起诱发。 IPSCs 很难分析去极化的影响因此，我们尝试使用培养细胞进一步阐明其机制。当细胞外环境不含Ca^2+时，诱发的IPSC被完全抑制。在这些无细胞外Ca 2+ 的条件下以50Hz进行高频刺激1分钟后，当细胞外液快速返回正常溶液时，约50％的细胞中诱发的IPSC的幅度降低。比之前的刺激还要强烈。这种反应被 EGTA-AM 预处理完全抑制。因此，不仅高K^+去极化刺激而且高频电刺激都可以独立于神经末梢处的细胞外Ca^2+浓度而增加末端内Ca^2+浓度。上述结果被认为有助于阐明控制神经递质释放的新机制。