分裂酵母SETドメイン蛋白質複合体の機能解析

裂殖酵母SET结构域蛋白复合物的功能分析

• 批准号: 17054045
• 负责人: 中山 潤一
• 金额: $ 2.94万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17054045/
• 关键词: ヒストン; メチル化; SETドメイン; 染色体分配

1.SETドメインタンパク質の持つ活性の検出と基質の同定SETドメインは、ヒストンのメチル化酵素に見いだされる保存されたドメインであり、エピジェネティックな遺伝子発現制御に重要な役割を持つと考えられるが、実際の機能や基質が同定されていない因子が数多く存在する。本年度の研究では、分裂酵母のSet11タンパク質に着目して研究を進めた。まず、set11の変異株では、染色体の分配異常をモニターするTBZという薬剤に対して耐性を示し、スピンドル微小管の脱重合を制御するklp5+と遺伝学的な相互作用を示すことが明らかになった。この結果はSet11の基質が、染色体の分配を制御する染色体の構造に重要な役割を持つことを示唆している。さらに大腸菌でSet11を発現精製し、ヒストンを含む細胞核分に対してメチル化活性を有するか検討を行った。その結果、約18kDa付近に、特異的にメチル化される基質が存在することが明らかとなった。この移動度は通常のコアヒストンでは説明されず、ヒストン以外のクロマチンタンパク質か、あるいは特殊な修飾を受けたヒストンと推測された。生化学的な手法によりこの画分をさらに分離し、基質の候補となる因子をLC/MS/MS解析で同定することに成功したので、現在遺伝学的な手法を用いて、その検証を進めている。2.SETドメイン酵素複合体の精製と相互作用因子の同定Set11の機能をさらに詳細に解析するため、Set11と相互作用する因子の解析を進めた。Set11にタンデムアフィニティータグを付加し、Set11と相互作用する因子の同定を試みたが、現在までに有意な因子の同定には至っていない。現在さらに精製の手法を改善し、同定を目指して検討を進めている。

1. SET结构域蛋白的活性检测和底物鉴定SET结构域是组蛋白甲基转移酶中的保守结构域，被认为在调节表观遗传基因表达中发挥重要作用，但许多因素的实际功能和底物尚未确定。已被识别。在今年的研究中，我们关注的是裂殖酵母的Set11蛋白。首先，研究表明set11突变菌株对监测异常染色体分离的药物TBZ具有抗药性，并且与控制纺锤体微管解聚的klp5+表现出遗传相互作用。这一结果表明 Set11 底物在控制染色体分离的染色体结构中发挥着重要作用。此外，我们在大肠杆菌中表达并纯化了Set11，并检测了其对含有组蛋白的细胞核是否具有甲基化活性。结果表明，在约18kDa附近存在特异性甲基化的底物。这种移动性无法用正常的核心组蛋白来解释，推测是由组蛋白以外的染色质蛋白或特殊修饰的组蛋白引起的。我们使用生化方法进一步分离了该部分，并通过 LC/MS/MS 分析成功鉴定了候选底物的因子。目前我们正在使用遗传方法进行验证。 2. SET域酶复合物的纯化和相互作用因子的鉴定为了更详细地分析Set11的功能，我们对与Set11相互作用的因子进行了分析。我们向 Set11 添加了串联亲和标签，并尝试识别与 Set11 相互作用的因子，但迄今为止尚未识别出重要的因子。我们目前正在努力进一步改进纯化方法并进行研究以期对其进行鉴定。