集光性超分子フィコビリソームの生きた状態における構造形成の仕組み

活体状态下捕光超分子藻胆体的结构形成机制

基本信息

批准号：
17053003
负责人：
仲本準
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Saitama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

フィコビリソームは、フィコビリタンパク質とリンカーポリペプチド(以下、リンカーと略す)などが数百分子集合して秩序正しく構築された巨大な複合体で、光エネルギーを吸収するアンテナの働きをする。本研究では、細胞におけるフィコビリソーム超分子の構築過程の解明を目的とした。実験材料には、シアノバクテリアSynechococcus PCC7942株を用い、フィコビリソーム構造の骨組みをなすと考えられているが、その不安定性ゆえに研究の進展がないリンカーに焦点をあてて、以下のような結果を得た。1.フィコビリソーム構築における分子シャペロンの役割フィコビリソームを解離させると3種類のリンカーが(高温では著しく)凝集したが、HtpG(Hsp90)は30kDaリンカーの凝集を効果的に阻止した。ゲルろ過カラムクロマトグラフィーで、HtpGと変性したフィコビリソームの可溶性複合体を単離した。30kDaリンカーを大腸菌で発現させ、不溶性のリンカーを尿素で可溶化し精製した。尿素を希釈し高温にするとリンカーは変性したが、リンカーと等モルのHtpGの添加によって凝集体形成が抑制された。HtpGと30kDaリンカーの複合体の結晶化条件を検討した。2.細胞内におけるフィコビリソーム構築過程の電子顕微鏡による解析永山國昭教授らが最近開発したヒルベルト微分コントラスト(HDC)電子顕微鏡により、急速凍結しただけの無固定無染色細胞におけるRuBisCO酵素分子が、従来の透過電子顕微鏡に比較してはるかに高コントラストで観察されることをまず明らかにした。これは、この顕微鏡で細胞内タンパク質分子が観察可能であることを示すものであるが、さらにフィコビリソーム・ロッド構造や、ロッド内のリンカーと考えられる構造物を検出した。電子顕微鏡による構造変化観察のために、フィコビリソームの分解・再構築が生じる培養条件を検討した。

藻胆体是由数百个藻胆蛋白分子和接头多肽（以下简称接头）有序组装而成的巨大复合物，充当吸收光能的天线。在本研究中，我们旨在阐明细胞中藻胆体超分子的组装过程。以蓝藻聚球藻PCC7942菌株为实验材料，我们重点研究了连接子，该连接子被认为形成了藻胆体结构的框架，但由于其不稳定，其研究尚未取得进展，并获得了以下结果。 1.分子伴侣在藻胆体组装中的作用当藻胆体解离时，三种类型的连接子聚集（在高温下显着），但HtpG（Hsp90）有效地阻止了30kDa连接子的聚集。通过凝胶过滤柱色谱法分离 HtpG 和变性藻胆体的可溶性复合物。在大肠杆菌中表达30kDa接头，用尿素溶解不溶性接头并纯化。稀释尿素和升高温度会使连接体变性，但向连接体中添加等摩尔的 HtpG 会抑制聚集体形成。我们研究了 HtpG 和 30kDa 连接子复合物的结晶条件。 2. 细胞内藻胆体构建过程的电子显微镜分析利用 Kuniaki Nagayama 等人最近开发的希尔伯特微分对比 (HDC) 电子显微镜，可以检测仅快速冷冻的未固定、未染色细胞中的 RuBisCO 酶分子首先，我们证明与电子显微镜相比，它可以以更高的对比度进行观察。这表明可以用该显微镜观察细胞内蛋白质分子，但我们还检测到藻胆体杆结构和被认为是杆内连接体的结构。为了使用电子显微镜观察结构变化，我们研究了导致藻胆体分解和重建的培养条件。