核内構造物への移動により制御される転写活性と蛋白質分解の共役的進行の可視化

转录活性和由进入核结构控制的蛋白质降解的耦合进程的可视化

基本信息

批准号：
17049004
负责人：
峯岸直子
金额：
$ 2.94万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

従来,蛋白質分解の研究は細胞の集団から蛋白質を抽出して免疫ブロット法等の解析を行うしか方法がなく,われわれも同様の方法により転写因子GATA2発現の細胞周期特異的な分解を見いだし報告した.しかし,このような解析には細胞周期を同調させた細胞集団が必要であり,多様な増殖特性を持つ細胞を持ち,細胞周期の同調が困難な正常組織の細胞を用いた解析は不可能であった.一方,免疫組織化学的方法においては,個々の細胞における発現を捉えられるものの,定量的解析が困難であった.そこで,我々は,転写因子等の核内因子と,細胞表面抗原,DNAの多重蛍光染色を行い,フローサイトメーターを用いて解析する方法を検討した.この方法では,性質の異なる細胞集団ごとにゲートをかけた解析が可能であり,また,個々の細胞の持つDNA量と転写因子発現の関係を2次元の図として解析することができる.我々は,造血幹細胞を含む細胞分画の解析を行い,GATA2発現はS期からG2期にかけて高く,M期に低下することを明らかにした.M期には細胞周期を進行させるサイクリン等の分解も起きるが,GATA2とサイクリンとDNAの3重染色の結果から,GATA2の分解はサイクリンBの分解より早い段階に起きることを見いだした.このような蛋白質分解制御はGATA2に特異的であり,類似のDNA結合特性を持つGATA1においては認められなかった.さらに,我々は緑色蛍光蛋白質とGATA2およびその変異体との融合蛋白質のフローサイトメーター解析を行い,サイクリン/Cdk複合体による複数のセリン/スレオニン残基のリン酸化がGATA2の細胞周期特異的分解を制御していることを明らかにした.

此前，研究蛋白质降解的唯一方法是从细胞群中提取蛋白质并进行免疫印迹等分析，我们也使用类似的方法来发现和报告转录因子 GATA2 表达的细胞周期特异性降解。分析需要细胞周期同步的细胞群，而使用来自正常组织的细胞进行分析是不可能的，因为正常组织的细胞具有不同的增殖特征并且细胞周期难以同步。另一方面，通过免疫组织化学方法，虽然可以检测单个细胞中的表达，但定量分析很困难，因此我们对转录因子、细胞表面抗原和DNA等核因子进行了多重分析。进行荧光染色并使用流式细胞仪进行分析。该方法可以对具有不同特性的每个细胞群进行门控分析，还可以分析单个细胞中 DNA 因子表达的数量和转录。我们分析了含有造血干细胞的细胞级分，发现GATA2表达在S期到G2期高，在M期下降，在M期，细胞周期蛋白和其他促进细胞周期的物质的降解也发生，但基于。通过GATA2、cyclin和DNA三重染色的结果，我们发现GATA2的降解发生在比cyclin B更早的阶段。这种蛋白水解调节是 GATA2 所特有的，在具有相似 DNA 结合特性的 GATA1 中没有观察到。此外，我们对绿色荧光蛋白和 GATA2 及其突变体的融合蛋白进行了流式细胞仪研究。我们的分析表明，多个蛋白被磷酸化。细胞周期蛋白/Cdk 复合物的丝氨酸/苏氨酸残基控制 GATA2 的细胞周期特异性降解。