RNAと蛋白質の複合体によるヌクレオチド選択の分子進化基礎研究

RNA-蛋白质复合物核苷酸选择的分子进化基础研究

• 批准号: 17026043
• 负责人: 富田 耕造
• 金额: $ 3.58万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17026043/
• 关键词: RNA; 合成; 酵素反応; 特異性; RNA合成; 鋳型非依存性; 分子進化

申請者はCCA付加酵素とRNA、付加されるヌクレオチドの三者複合体構造を発表しているが(Tomita et al.,Nature 2004)、この構造解析から「付加されるヌクレオチドの結合ポケットがプライマーの3'末端のヌクレオチドと酵素の協同で形成される」ということが明らかになった。これは、これまで、提唱されてきた幾つかのCCA付加モデルのうち、ヌクレオチドの鋳型が酵素だけではなく、RNAと酵素の複合体(リボヌクレオプロテイン;RNP)の協同で行われるとする"タンパク質とRNAの協調的な鋳型"モデルの本質を示すものであった。今回申請者はRNAの3'末端へ変異を導入し、N74N75(N=A、G、C、U)の16種類のRNA、またN74(N=A、G、C、U)の4種類のRNA、計20種類の変異RNAを作成し、クラスI CCA付加酵素によるATPあるいはCTPの取り込みを解析した。これらの結果、N74をA、G、などへ変異を導入しても、75へのCTPの取り込みはそれほど低下しないが影響はないが、その後の76へのATPの取り込み率は非常に低下することが明らかになった。これらの結果は、CCA付加反応においてRNAの3'末端の塩基組成は連続的に酵素によってモニターされていることを示唆する。これらの分子基盤を詳細に明らかにするため、これらの変異RNA(N74あるいはC74N75、N74C75)と酵素の複合体結晶、計9種類(野生型RNAを用いたものは除く)作製した。これらの結晶は野生型RNAをもちいたといと同じ晶系に属し、かつ格子定数もほぼ同じであった。分子置換方によってこれらの結晶のうちいくつかに関しては構造が決定できており、今後の解析によって、CCA付加酵素によるCCA付加反応過程でのRNAの末端モニターリングシステムの詳細な分子基盤が明白になると期待できる。

申请人已经发表了CCA添加酶、RNA和添加的核苷酸的三元复合物的结构(Tomita等，Nature 2004)，但是该结构分析表明添加的核苷酸的结合口袋位于引物中结果表明，该酶是由3'端的核苷酸与酶共同作用而形成的。在已经提出的几种CCA加法模型中，这是基于这样的假设：核苷酸模板不仅是一种酶，而且是RNA和酶（核糖核蛋白；RNPs）共同作用的复合物，并证明了“”的本质。 RNA的合作模板”模型。这次，申请人在RNA的3'端引入了突变，产生了16种RNA，N74N75（N = A，G，C，U）和4种RNA，N74（N = A，G，C） ，U)。我们总共创建了 20 种突变体 RNA，并分析了 I 类 CCA 添加酶对 ATP 或 CTP 的摄取。由此可见，即使N74突变为A、G等，75对CTP的摄取也不会明显减少或受到影响，但随后76对ATP的摄取率会大幅降低。这些结果表明，CCA 加成反应中的酶连续监测 RNA 3' 末端的碱基组成。为了详细阐明这些分子基础，我们总共创建了这些突变RNA（N74、C74N75、N74C75）和酶（不包括使用野生型RNA的酶）的九种复杂晶体。这些晶体与使用野生型RNA的晶体属于相同的晶体系统，并且具有几乎相同的晶格常数。其中一些晶体的结构已通过分子取代方法确定，未来的分析有望揭示CCA加成酶在CCA加成反应过程中RNA末端监测系统的详细分子基础。

项目成果

RNAの3'末端修復の分子メカニズム

RNA 3端修复的分子机制

• 发表时间: 2007
• 期刊: 実験医学(羊土社) 25
• 作者: Yoneyama;M.;Fujita;T.;藤田尚志;小野口和英;米山光俊;尾野本浩司;米山光俊;渡邊伸昌;富田耕造
• 通讯作者: 富田耕造

タンパク質合成を支えるtRNAの成熟化

支持蛋白质合成的 tRNA 成熟

• 发表时间: 2007
• 期刊: 生化学(日本生化学会) 79
• 作者: Yoneyama;M.;Fujita;T.;藤田尚志;小野口和英;米山光俊;尾野本浩司;米山光俊;渡邊伸昌;富田耕造;富田耕造
• 通讯作者: 富田耕造

転移RNA成熟化プロセス tRNAの末端へのヌクレオチド付加とエディティングの分子機構の類似性

转移RNA成熟过程：tRNA末端核苷酸添加和编辑分子机制的相似性

• 发表时间: 2005
• 期刊: 実験医学(羊土社) Vol.23
• 作者: Tomita K;Ishitani R;Fukai S;Nureki O;富田 耕造
• 通讯作者: 富田 耕造