セプチン系細胞骨格と脂質2重膜との相互作用の解析

septin细胞骨架与脂质双层膜的相互作用分析

基本信息

批准号：
16048214
负责人：
木下専
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16048214/
关键词：
細胞質分裂収縮輪自己集合 GTPアーゼ細胞骨格

项目摘要

研究計画1:セプチン・リポソーム間の相互作用の解析組み換えセプチン複合体(野生型および各種変異体)とリポソームを作成・ゲルろ過精製し、電子顕微鏡で形状観察した。現在、両者の親和性を表面プラスモン共鳴法(Biacore)で測定するための条件検討を行っており、次年度以降報告予定である。研究計画2:細胞膜直下におけるセプチン集合体と細胞膜のダイナミックな相互作用の可視化と定量的解析培養細胞や遺伝子改変マウスの精子を用いて、細胞膜の裏打ちないし膜蛋白の拡散障壁の構成成分としてのセプチン系細胞骨格の機能を検討した。まず、哺乳類培養細胞の分裂時における染色体の赤道部への配列と分配、さらにそれに引き続く細胞質分裂において、微小管上から細胞膜直下のアクチン性収縮輪へとダイナミックにYFP-セプチンの局在が移行することをリアルタイム3D蛍光顕微鏡を用いて詳細に解析した。さらに、その局在のいずれもが細胞分裂に必須であることをRNAi技法を駆使して実証した。この研究により、細胞分裂において、セプチン細胞骨格が主要細胞骨格系と同様に重要かつ独自の役割を果たすことが明確に示された。次いで、精子尾部細胞膜において膜蛋白の拡散障壁として知られている輪状小体(annulus)の主成分がセプチンフィラメントの高次集合体であることを個体レベルで証明した(文献2)。この発見は精子形成の分子機構に迫るものであり、生物学的な興味に加えて臨床的にもヒトの男性不妊症研究に資する有意義な成果である。Sept4欠損マウス精子が輪状小体を持たないことを利用し、蛍光ラベルした脂質2重膜や膜蛋白の動態が正常コントロールとどのように異なるかをFRAP法を用いて解析するという課題が残った。

研究计划1：septin与脂质体相互作用的分析通过凝胶过滤制备并纯化重组septin复合物（野生型和各种突变体）和脂质体，并使用电子显微镜观察其形状。我们目前正在研究使用表面等离子共振（Biacore）测量两者之间亲和力的条件，并计划从明年开始对此进行报告。研究计划2：septin聚集体与细胞膜正下方的细胞膜之间动态相互作用的可视化和定量分析使用来自转基因小鼠的培养细胞和精子，我们将研究septin作为细胞膜衬里或细胞膜组成部分的作用我们研究了系统细胞骨架的功能。首先，在培养的哺乳动物细胞分裂期间，染色体向赤道排列和分布，然后在胞质分裂期间，YFP-Septin的定位动态地从微管上转移到细胞膜下方的光化收缩环上。使用实时 3D 荧光显微镜。此外，利用 RNAi 技术，我们证明了这些定位中的每一个对于细胞分裂都是必不可少的。这项研究清楚地表明，septin 细胞骨架与主要的细胞骨架系统一样，在细胞分裂中发挥着重要而独特的作用。接下来，我们在个体水平上证明了环带（被称为精子尾部质膜中膜蛋白的扩散屏障）的主要成分是隔膜丝的高阶聚集体（参考文献 2）。这一发现揭示了精子发生的分子机制，除了具有生物学意义外，这是一个有意义的结果，将从临床角度为人类男性不育研究做出贡献。利用 Sept4 缺陷的小鼠精子没有环体的事实，剩下的挑战是使用 FRAP 方法来分析荧光标记的脂质双层膜和膜蛋白的动力学与正常对照有何不同。