脂肪細胞褐色化転換転写因子"FOXC2"による脂肪細胞形質決定因子の体系的同定

通过脂肪细胞褐变转录因子“FOXC2”系统鉴定脂肪细胞性状决定因素

基本信息

批准号：
16046218
负责人：
大澤春彦
金额：
$ 4.99万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

白色/褐色という脂肪細胞の形質決定因子は、肥満とインスリン抵抗性を同時に改善する画期的な治療薬の標的となりうる。事実、転写因子FOXC2を脂肪細胞特異的に過剰発現させたマウスにおいて、白色脂肪細胞が褐色脂肪細胞様に変化し、体重減少と共にインスリン感受性が高まることが報告された(Cell 106:563,2001)。そこで本研究では、FOXC2関連脂肪細胞形質決定因子を独創的手法による体系的同定を試みた。1)FOXC2の脂筋細胞形質への効果、2)脂肪細胞形質特異的標的遺伝子の同定、3)脂肪細胞形質特異的FOXC2結合蛋白の同定について進めた。1)野生型及び変異型のFOXC2 cDNAをレトロウイルスベクターに導入した。さらにこれらを分化前の3T3-L1細胞にトランスフェクションした。その後、脂肪細胞分化を誘導し、形質の変化を評価した。その結果、野生型FOXC2により白色脂肪細胞への分化が阻害された。変異型FOXC2では異なる応答を示した。野生型の導入によりFOXC2のmRNAの発現が増強していることを確認した。また、分化阻害が脂肪細胞分化に関わる転写因子の発現抑制を伴うことを見出した。2)アレイに向けて野生型FOXC2導入ありとなしにおいてRNAを経時的に抽出した。3)既に確立したイーストツーハイブリッド法を用いて、3T3-L1細胞のcDNAライブラリーをFOXC2をbaitとしてスクリーニングした結果、予想よりも早くFOXC2結合蛋白として複数の陽性クローンを得た。これらの蛋白とFOXC2の相互作用をGST-pull downによりin vitroで確認した。さらに、GAL4結合配列とE1b TATA boxを有するluciferaseレポーターとGAL4DNA結合領域にFOXC2を融合させた蛋白の発現ベクター、ならびに同定した蛋白の発現ベクターを構築した。これらを同時にトランスフェクシヨンし、FOXC2の転写活性化能への影響をIn vitroで解析した。

白色/棕色脂肪细胞性状决定因素可能成为同时改善肥胖和胰岛素抵抗的创新治疗药物的目标。事实上，据报道，在以脂肪细胞特异性方式过度表达转录因子 FOXC2 的小鼠中，白色脂肪细胞变成类似棕色脂肪细胞，并且胰岛素敏感性随着体重减轻而增加（Cell 106:563, 2001）。因此，在本研究中，我们尝试使用原始方法系统地鉴定FOXC2相关的脂肪细胞性状决定因素。我们研究了 1) FOXC2 对脂肪肌细胞性状的影响，2) 脂肪细胞性状特异性靶基因的鉴定，以及 3) 脂肪细胞性状特异性 FOXC2 结合蛋白的鉴定。 1)将野生型和突变型FOXC2 cDNA引入逆转录病毒载体。此外，在分化前将它们转染至3T3-L1细胞中。此后，诱导脂肪细胞分化并评估性状的变化。结果，野生型 FOXC2 抑制分化为白色脂肪细胞。突变体 FOXC2 显示出不同的反应。证实FOXC2 mRNA的表达通过引入野生型而增强。我们还发现，分化的抑制伴随着参与脂肪细胞分化的转录因子表达的抑制。 2) 随着时间的推移，在引入和未引入野生型 FOXC2 的情况下提取阵列的 RNA。 3)利用已经建立的酵母二杂交方法以FOXC2为诱饵筛选3T3-L1细胞的cDNA文库，我们比预期更早地获得了多个FOXC2结合蛋白阳性克隆。这些蛋白质和 FOXC2 之间的相互作用在体外通过 GST-pull down 得到证实。此外，我们构建了具有 GAL4 结合序列和 E1b TATA 盒的荧光素酶报告基因、FOXC2 与 GAL4 DNA 结合区融合的蛋白质表达载体以及已鉴定蛋白质的表达载体。同时转染它们，并在体外分析它们对 FOXC2 转录激活能力的影响。