染色体工学を用いたセントロメアを中心とするゲノム構築原理の解明

利用染色体工程阐明以着丝粒为中心的基因组构建原理

基本信息

批准号：
16011260
负责人：
深川竜郎
金额：
$ 4.8万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16011260/
关键词：
セントロメア DT40 CENP-H CENP-I Nuf2 Hec1 RNAiマシーナリー Dicer

项目摘要

ゲノム配列が解読された後は、ゲノムそのものが構築される原理を解明することが重要である。本研究では複雑なゲノム構築原理の内、ゲノム分配機構に焦点を当て染色体工学的な手法を用いて、高等動物セントロメアの形成機構の解明を目指す。本年度は、これまでの研究の継続性を重視してニワトリB細胞由来のDT40細胞を用いて新規セントロメアタンパク質の同定と機能解析を行った。また、セントロメア構築とRNAiマシーナリーとの関連の解明を目指した。以下に結果を述べる。1)昨年度までの研究で同定したKm23aおよびKm23bのコンディショナルノックアウト細胞を樹立してその表現型を解析した。その結果、Km23aおよびKm23bのノックアウト細胞では、異常スピンドルとチェックポイント制御の異常が観察された。ダイニンと結合することから、Km23aおよびbはモータータンパク質に関連したスピンドルチェックポイントタンパク質である可能性が示唆された。2)セントロメア構成タンパク質であるCENP-HおよびCENP-Iの発現をタグ付き融合タンパク質の発現に置換した細胞株を樹立して抗タグ抗体を用いた免疫沈降実験を行った。その結果、CENP-HとCENP-Iを含む巨大複合体を精製できた。質量分析によるアミノ酸配列の決定に引き続きcDNAクローニングを行い、複合体に含まれる5種類のタンパク質を同定した。いずれも、細胞周期を通じてセントロメアへ局在していた。3)ヒト染色体由来の人工染色体を保持するDT40細胞を対象にして、RNAiマシーナリーに関与するDicer遺伝子の条件的ノックアウト細胞を樹立した。Dicerの発現が失われた細胞で、ヒト人工染色体のセントロメア領域からのRNA転写が確認できた。RNaseプロテクションアッセイの結果、2本鎖RNAを形成することが示唆された。また、Dicerノックアウト細胞で、ヘテロクロマチンの形成異常が確認できた。

基因组序列被解码后，阐明基因组本身的构建原理非常重要。在本研究中，我们旨在通过关注基因组划分机制（基因组构建的复杂原理之一）并利用染色体工程技术来阐明高等动物着丝粒的形成机制。今年，为了强调先前研究的连续性，我们使用源自鸡 B 细胞的 DT40 细胞鉴定并功能分析了新型着丝粒蛋白。我们还旨在阐明着丝粒构建和 RNAi 机制之间的关系。结果描述如下。 1）我们建立了截至去年的研究中鉴定的Km23a和Km23b条件敲除细胞，并分析了它们的表型。结果，在 Km23a 和 Km23b 敲除细胞中观察到纺锤体异常和检查点控制异常。与动力蛋白的结合表明 Km23a 和 b 可能是与运动蛋白相关的纺锤体检查点蛋白。 2)我们建立了将着丝粒组成蛋白CENP-H和CENP-I的表达替换为标记融合蛋白的表达的细胞系，并使用抗标记抗体进行了免疫沉淀实验。结果，我们能够纯化含有 CENP-H 和 CENP-I 的大型复合物。通过质谱法确定氨基酸序列后，进行了 cDNA 克隆，并鉴定了复合物中包含的五种蛋白质。在整个细胞周期中，所有这些都定位于着丝粒。 3）我们使用携带源自人类染色体的人工染色体的DT40细胞，建立了参与RNAi机制的Dicer基因的条件敲除细胞。在 Dicer 表达缺失的细胞中，证实了人类人工染色体着丝粒区域的 RNA 转录。 RNase保护测定结果表明形成了双链RNA。此外，在 Dicer 敲除细胞中也证实了异染色质形成的异常。