雌性化及び雄性化指標遺伝子のクローニングとその発現蛋白に対する特異的抗体の作製

克隆女性化和男性化指示基因并生产针对其表达蛋白的特异性抗体

• 批准号: 14042257
• 负责人: 星 英之
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: Osaka Prefecture University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14042257/
• 关键词: 野生生物; モレキュラークローニング; 内分泌攪乱; vitellogenin; DMRT1; タンパク発現; RT-PCR; バイオモニタリング; バイオマーカー; 鳥類; は虫類; ビテロジェニン; VMO-1; クローニング; 野生生物; モレキュラークローニング; 内分泌攪乱; vitellogenin; DMRT1; タンパク発現; RT-PCR; バイオモニタリング; バイオマーカー; 鳥類; は虫類; ビテロジェニン; VMO-1; クローニング

昨年に引き続き、クサガメ(Chimemys reevesii)及びカワウ(Phalacrocorax carbo)の雌性指標遺伝子vitel-logenin(VTG)のクローニングを行った。その結果、クサガメから、743アミノ酸をコードする2,229bpのVTG cDNA断片(CRVTG)、カワウから371アミノ酸をコードする1,253bpのVTG cDNA断片(PcVg3')のクローニング及び塩基配列の決定に成功した。決定された塩基配列を元にクサガメ及びカワウのVTGに特異的なプライマーを作製し、半定量的なRT-PCRにより以下の2点を検討した。1)幼若クサガメ4個体に対し、500μg/kg B.W.の17β-estradiol (E_2)を体腔内に単回投与し、投与前、投与後6、12,24,48時間目および5、8、16日目に採血および肝臓部分切除術を行い、RT-PCRにより肝臓でのVTG mRNAを、クサガメVTG mAbを用いたウェスタンブロッティングにより血清中VTGの発現量を解析した。その結果、E_2を投与した6時間後には、投与前と比較して有意にVTG mRNAが誘導され、24時間後には最大の発現を示した。その後、VTG mRNAの発現は、48時間後から緩やかな減少傾向を示し、投与の8日後には、投与前の発現量まで減少した。一方、血清中VTGタンパクの発現は、E_2投与後8日目に有意な増加を示した。この事から、VTG mRNAはE_2曝露が最近あったことの指標として有効であることが示された。2)三重県から、繁殖期に当たる、4月下旬に捕獲したカワウ(オス7個体、メス5個体)について、β-actin mRNAを内部標準とした、VTG mRNAの半定量的RT-PCRを行った。その結果、本来、発現がほとんど認められないと予想されるオスでも、VTG mRNAの発現が認められた。さらに、驚くべき事に、VTG mRNAの発現の雌雄差をt-検定により解析したところ、P<0.05を有意とした場合、雌雄差は認められなかった。このことから、カワウのオスに雌性化が起こっていることが示唆された。さらに、クサガメのDMRT1及びカワウのVTGについては、pGEX4T2ベクター及びBL21(DE3)によるタンパク発現を試み、それぞれのタンパクの発現が確認された。現在、抗体作成に向けて、タンパクの精製を行っている。

去年，克隆了去年的蜡乌龟（Chimemys Reevesii）和骨龟（Phalacrocorax carbo）的维特 - 洛基因（VTG），是一种女性性指标基因。结果，我们成功克隆并确定了2,229 bp vtg cDNA片段（CRVTG）的碱基序列，编码了来自乌龟的743个氨基酸和1,253 bp vtg cDNA片段（PCVG3'），编码371个来自Turtle的氨基酸的氨基酸。基于确定的碱序列，制备了针对乌龟和椭圆形乌龟VTG的引物，并通过半定量RT-PCR检查了以下两个点。 1）单剂量为500μg/kg b.w.在施用后的6、12、24、48小时和16天以6、12、24、48小时，5、8和16天进行部分肝切除的17β-雌二醇（E_2），并收集血液并进行部分肝切除。通过RT-PCR分析肝脏中的VTG mRNA，并使用Turtle VTG mAb分析了Western印迹。结果，与给药前6小时后，在给药后6小时可显着诱导VTG mRNA，并在24小时显示最大表达。然后，VTG mRNA的表达从48小时开始逐渐下降，在给药后8天，表达水平降低到预进剂水平。另一方面，在施用E_2后的第8天，血清中VTG蛋白的表达显着增加。这表明VTG mRNA作为最近暴露的指标有效。 2）在4月下旬，在MIE县的繁殖季节，使用β-肌动蛋白mRNA作为内标，对VTG mRNA的半定量RT-PCR进行了对兰花（7名男性和5名雌性）进行的。结果，在男性中也观察到了VTG mRNA的表达，最初预计几乎没有代表性。此外，令人惊讶的是，当通过t检验分析VTG mRNA表达的男女女性女性差异时，当P <0.05显着时，未观察到男性女性的差异。这表明雄兰花是女性。此外，对于乌龟的DMRT1和VTG，PGEX4T2载体和BL21（DE3）尝试了蛋白质表达，并确认了每种蛋白质的表达。目前，正在纯化蛋白质以准备生产抗体。