大腸菌シャペロニンの機能発現の速度論

大肠杆菌伴侣蛋白功能表达动力学

• 批准号: 14037214
• 负责人: 桑島 邦博
• 金额: $ 3.01万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14037214/
• 关键词: 分子シャペロン; 蛋白質フォールディング; シャペロニン; アロステリック転移; X線溶液散乱; ストップトフロー; 蛍光スペクトル; スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ

分子シャペロンの作用の分子機構の研究は、物理化学的な試験管内蛋白質フォールディングと細胞内での生命現象との関連を解き明かす鍵となる基礎生物科学の重要な課題である。本研究では、ストップトフロー蛍光スペクトルとストップトフローX線小角散乱の速度論的手法を用いて、(1)シャペロニンGroELのATPによるアロステリックな構造転移を構造学的に検証する、(2)プロリンを含まぬ疑似野生型スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase(pro-))の変異体を標的として用いて、標的蛋白質の巻き戻り速度過程に及ぼすGroELの影響を解析する。以下の結果が得られた。(1)ストップトフローX線散乱法によりGroELのアロステリック転移(T状態よりR状態値の転移)の速度過程を直接観測することに初めて成功した。反応速度定数は5℃で3-5 s^<-1>であり、これはストップトフロー蛍光スペクトルにより観測したトリプトファンTrp挿入変異体(Y485W)の第二相の速度定数と同じであった。(2)上の結果より、蛍光スペクトルで観測された第一相はT状態への非協同的なATPの結合、第二相がT⇔Rのアロステリック転移であることがわかった。速度論的アロステリックモデルを用いてすべての結果を合理的に説明することができた。T状態、R状態、及び、アロステリック転移の遷移状態におけるATPの結合定数や速度論的パラメータが定量的に明らかになり、遷移状態の構造がR状態の構造に近いことがわかった。(3)ストップトフロー蛍光スペクトルを用いて、SNase(pro-)にA69Tの変異を導入した変異体の酸変性状態からの巻き戻り反応をGroEL非存在下と存在下で行い、両者を比較した。GroEL存在下では巻き戻り反応がGroELと結合したまま進行し、SNaseのフォールディングのエネルギー地形そのものがGroELとの結合により変わることが明らかとなった。この結果は分子シャペロンであるGroELが標的蛋白質のフォールディングエネルギー地形を変えることを直接示した最初の例である。

分子伴侣作用的分子机制研究是基础生物科学的重要课题，是阐明体外蛋白质折叠物理化学与细胞内生物现象之间关系的关键。在本研究中，我们使用停流荧光光谱和停流小角X射线散射动力学方法来（1）结构验证ATP诱导的伴侣蛋白GroEL的变构结构转变，以及（2）结构验证ATP - 诱导伴侣蛋白 GroEL 的变构结构转变 使用不含 SNase(pro-) 的伪野生型葡萄球菌核酸酶 (SNase(pro-)) 突变体作为靶标，我们将分析 GroEL 对解旋的影响。目标蛋白的速率过程。得到以下结果。 (1)我们首次成功地利用停流X射线散射直接观察了GroEL的变构转变(从T态到R态值的转变)的动力学过程。 5℃下反应速率常数为3-5s^-1，与停流荧光光谱观察到的色氨酸Trp插入突变体(Y485W)第二相的速率常数相同。 (2)由上述结果发现，荧光光谱中观察到的第一相是ATP与T态的非合作结合，第二相是T⇔R的变构转变。所有结果都可以使用动力学变构模型合理地解释。定量阐明了ATP在T态、R态和变构过渡态的结合常数和动力学参数，发现过渡态的结构与R态的结构接近。 (3)使用停流荧光光谱法，在不存在和存在GroEL的情况下，对具有从酸变性状态引入的A69T突变的突变体SNase(pro-)进行解旋反应，并对两者进行比较。结果表明，在 GroEL 存在的情况下，当 SNase 与 GroEL 结合时，解旋反应会继续进行，并且 SNase 折叠本身的能量景观会因与 GroEL 的结合而发生变化。这一结果首次直接证明分子伴侣 GroEL 改变了目标蛋白的折叠能量景观。

项目成果

M.Arai: "Fast Compaction of alpha-lactalbumin During Folding Studied by Stopped-Flow X-ray Scattering"J. Mol. Biol.. 321. 121-132 (2002)

M.Arai：“通过停流 X 射线散射研究折叠过程中 α-乳清蛋白的快速压缩”J。

K.Kuwajima: "The use of the time-resolved X-ray solution scattering for studies of globular proteins"Spectroscopy : an international J.. 16. 127-138 (2002)

K.Kuwajima：“使用时间分辨 X 射线溶液散射研究球状蛋白质”光谱学：国际 J.. 16. 127-138 (2002)

K.Kuwajima: "Chaperone-Affected Folding of Globular Proteins"J. Biol. Phys.. 28. 77-93 (2002)

K.Kuwajima：“分子伴侣影响的球状蛋白折叠”J。

K.Kuwajima: "The Role of the Molten Globule State in Protein Folding : The Search for a Universal View of Folding"Proc. Indian Nat. Sci. Acad.. 68. 333-240 (2002)

K.Kuwajima：“熔球状态在蛋白质折叠中的作用：寻找折叠的普遍观点”Proc。

T.Inobe: "Equilibrium and Kinetics of the Allosteric Transition of GroEL Studied by Solution X-ray Scattering and Fluorescence Spectroscopy"J. Mol. Biol.. 327. 183-191 (2003)

T.Inobe：“通过溶液 X 射线散射和荧光光谱研究 GroEL 变构转变的平衡和动力学”J。