大腸菌シャペロニンの機能発現の速度論

大肠杆菌伴侣蛋白功能表达动力学

• 批准号: 14037214
• 负责人: 桑島 邦博
• 金额: $ 3.01万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14037214/
• 关键词: 分子シャペロン; 蛋白質フォールディング; シャペロニン; アロステリック転移; X線溶液散乱; ストップトフロー; 蛍光スペクトル; スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ

分子シャペロンの作用の分子機構の研究は、物理化学的な試験管内蛋白質フォールディングと細胞内での生命現象との関連を解き明かす鍵となる基礎生物科学の重要な課題である。本研究では、ストップトフロー蛍光スペクトルとストップトフローX線小角散乱の速度論的手法を用いて、(1)シャペロニンGroELのATPによるアロステリックな構造転移を構造学的に検証する、(2)プロリンを含まぬ疑似野生型スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase(pro-))の変異体を標的として用いて、標的蛋白質の巻き戻り速度過程に及ぼすGroELの影響を解析する。以下の結果が得られた。(1)ストップトフローX線散乱法によりGroELのアロステリック転移(T状態よりR状態値の転移)の速度過程を直接観測することに初めて成功した。反応速度定数は5℃で3-5 s^<-1>であり、これはストップトフロー蛍光スペクトルにより観測したトリプトファンTrp挿入変異体(Y485W)の第二相の速度定数と同じであった。(2)上の結果より、蛍光スペクトルで観測された第一相はT状態への非協同的なATPの結合、第二相がT⇔Rのアロステリック転移であることがわかった。速度論的アロステリックモデルを用いてすべての結果を合理的に説明することができた。T状態、R状態、及び、アロステリック転移の遷移状態におけるATPの結合定数や速度論的パラメータが定量的に明らかになり、遷移状態の構造がR状態の構造に近いことがわかった。(3)ストップトフロー蛍光スペクトルを用いて、SNase(pro-)にA69Tの変異を導入した変異体の酸変性状態からの巻き戻り反応をGroEL非存在下と存在下で行い、両者を比較した。GroEL存在下では巻き戻り反応がGroELと結合したまま進行し、SNaseのフォールディングのエネルギー地形そのものがGroELとの結合により変わることが明らかとなった。この結果は分子シャペロンであるGroELが標的蛋白質のフォールディングエネルギー地形を変えることを直接示した最初の例である。

研究分子伴侣作用的分子机制是基本生物科学的重要问题，这是揭示物理化学体外蛋白质折叠与细胞内生命现象之间关系的关键。在这项研究中，我们使用（1）使用（1）使用（1）使用（1）使用（1）使用（1）使用（1）使用（1）使用（1）使用（1）使用（1）使用伴侣蛋白gro中的ATP在结构上验证ATP的结构转移，并使用伴侣蛋白gro的结构转移（2）使用（2）使用（2）使用（2）在结构上验证（2）在结构上验证（2）在结构上验证（2）包含脯氨酸。获得了以下结果：（1）这是我们第一次能够直接观察到使用stop-flow X射线散射的GROEL中变构转变的动力学过程（R状态的转变）。在5°C下的反应速率常数为3-5 s^<-1>，与通过停止流荧光光谱观察到的色氨酸TRP插入突变体（Y485W）的第二相的速率常数相同。 （2）上面的结果表明，在荧光光谱中观察到的第一相是ATP与T状态的非合作结合，第二相是T⇔R之间的变构跃迁。所有结果都可以使用动力学变构模型合理解释。已定量揭示了T态，R态和变构跃迁的T-StATE和过渡态的ATP的结合常数和动力学参数，并且发现过渡态的结构与R状态的结构相似。 （3）使用停止流荧光光谱，在不存在和存在凹槽的情况下，将引入A69T突变引入SNase（Pro-）的突变体的酸性状态的反应，并比较了两者。在存在凹槽的情况下，倒带反应在仍与凹槽上键合的同时进行，并且已经揭示了SNase折叠本身的能量形态由于其与凹槽的结合而变化。该结果是直接证明分子伴侣凹槽改变靶蛋白的折叠能形貌的第一个例子。

项目成果

M.Arai: "Fast Compaction of alpha-lactalbumin During Folding Studied by Stopped-Flow X-ray Scattering"J. Mol. Biol.. 321. 121-132 (2002)

M.Arai：“通过停流 X 射线散射研究折叠过程中 α-乳清蛋白的快速压缩”J。

K.Kuwajima: "The use of the time-resolved X-ray solution scattering for studies of globular proteins"Spectroscopy : an international J.. 16. 127-138 (2002)

K.Kuwajima：“使用时间分辨 X 射线溶液散射研究球状蛋白质”光谱学：国际 J.. 16. 127-138 (2002)

K.Kuwajima: "Chaperone-Affected Folding of Globular Proteins"J. Biol. Phys.. 28. 77-93 (2002)

K.Kuwajima：“分子伴侣影响的球状蛋白折叠”J。

K.Kuwajima: "The Role of the Molten Globule State in Protein Folding : The Search for a Universal View of Folding"Proc. Indian Nat. Sci. Acad.. 68. 333-240 (2002)

K.Kuwajima：“熔球状态在蛋白质折叠中的作用：寻找折叠的普遍观点”Proc。

T.Inobe: "Equilibrium and Kinetics of the Allosteric Transition of GroEL Studied by Solution X-ray Scattering and Fluorescence Spectroscopy"J. Mol. Biol.. 327. 183-191 (2003)

T.Inobe：“通过溶液 X 射线散射和荧光光谱研究 GroEL 变构转变的平衡和动力学”J。