染色体工学を用いたセントロメアを中心とするゲノムオペレーティングシステムの解明

利用染色体工程阐明以着丝粒为中心的基因组操作系统

基本信息

批准号：
14014255
负责人：
深川竜郎
金额：
$ 3.84万
依托单位：
The Graduate University for Advanced Studies
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14014255/
关键词：
ゲノム工学セントロメア CENP-A DT40 Nuf2 プロテオミクス染色体工学 FRAP

项目摘要

ゲノム複製や分配が正常に行われるために働くゲノムオペレーティングシステム(ゲノムOS)を理解することは、ゲノム配列が解読された後のゲノム生物学の中心的な課題の一つである。本研究では複雑なゲノムOSの内、ゲノム分配機構に焦点を当て染色体工学的な手法を用いて、高等動物セントロメアの形成機構の解明を目指している。セントロメアは染色体分配に本質的な役割を担うDNA-タンパク質の複合体である。我々は全真核生物に共通した分配機構の解明を目指し、各種セントロメアタンパク質の機能解析を行っている。本年度は、ニワトリB細胞由来のDT40細胞を用いてCENP-A、Nuf2、ZW250を対象に研究を進めた。CENP-AとNuf2については詳細なgenotype解析を行い条件的ノックアウト細胞の樹立を確認した。ZW250については、細胞内局在を明らかにできるなどの研究の進展はあったが、ノックアウト株の樹立にまではいたっていない。CENP-Aのノックアウト細胞の解析の結果、細胞分裂時期のみならず、間期にも異常が生じることが明らかになった。また、CENP-A欠損細胞で、CENP-C,-H,-Iの局在異常が認められた。Nuf2のノックアウト細胞は、約450分の細胞分裂の遅延が起きた後、次の細胞周期に進行することなく死滅した。Nuf2の欠損した染色。体のセントロメアにはCENP-C、-H、-Iが存在していた。また、Nuf2がMad2と直接結合することが明らかになったが、ノックアウト細胞でBubR1の局在異常は認められなかった。Nuf2の欠損細胞における細胞分裂遅延は、チェックポイント依存的であるため、BubR1の活性化がその要因の一つであると考えられた。さらに、FRAP実験を行いNuf2は間期ではダイナミックな挙動であるが、分裂期では非常に安定した構造をとることが明らかになった。Nuf2-GFPを発現するDT40細胞を樹立して抗GFP抗体ビーズを用いた免疫沈降を行い、得られたバンドをLC-MS/MSを用いたプロテオミクス解析することによって新規セントロメアタンパク質を得た。

了解确保正常基因组复制和分区的基因组操作系统（genome OS）是基因组测序后基因组生物学的核心挑战之一。在本研究中，我们旨在通过关注复杂基因组操作系统的基因组划分机制并利用染色体工程技术来阐明高等动物着丝粒的形成机制。着丝粒是 DNA-蛋白质复合物，在染色体分离中发挥重要作用。我们正在对各种着丝粒蛋白进行功能分析，目的是阐明所有真核生物共有的分布机制。今年，我们使用源自鸡 B 细胞的 DT40 细胞进行了针对 CENP-A、Nuf2 和 ZW250 的研究。对于CENP-A和Nuf2，我们进行了详细的基因型分析并确认了条件敲除细胞的建立。 ZW250的研究已取得进展，包括阐明其细胞内定位的能力，但尚未导致敲除菌株的建立。对 CENP-A 敲除细胞的分析表明，异常不仅发生在细胞分裂期间，而且发生在分裂间期。此外，在CENP-A缺陷细胞中观察到CENP-C、-H、-I的异常定位。 Nuf2 敲除细胞在细胞分裂延迟约 450 分钟后死亡，没有进入下一个细胞周期。 Nuf2 染色不足。 CENP-C、-H和-I存在于身体的着丝粒中。还发现Nuf2直接与Mad2结合，但在敲除细胞中没有观察到BubR1的异常定位。由于 Nuf2 缺陷细胞的细胞分裂延迟是检查点依赖性的，因此 BubR1 的激活被认为是因素之一。此外，FRAP 实验表明，Nuf2 在间期表现动态，但在有丝分裂期间采用非常稳定的结构。通过建立表达 Nuf2-GFP 的 DT40 细胞，使用抗 GFP 抗体珠进行免疫沉淀，并使用 LC-MS/MS 对获得的条带进行蛋白质组分析，获得了一种新型着丝粒蛋白。