大脳皮質構造形成機構におけるCNR遺伝子多重欠損マウスの解析

多种CNR基因缺陷小鼠大脑皮层结构形成机制分析

基本信息

批准号：
13035054
负责人：
先崎浩次
金额：
$ 4.8万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

CNR分子群は大脳皮質形成機構に関わるReelin分子の多重受容体として機能していることが示唆されており、CNR分子群の分子機能解析により大脳皮質層構造形成機構の一端が明らかにされることが期待される。本研究では、特にCNR分子群の分子多様性の機能を明らかにすることを目的として、(1)CNR遺伝子多重欠損マウスの作製および解析、(2)各CNR特異抗体作製によるCNR分子多様性の機能解析、の2つのアプローチによる解析を行った。(1)CNR分子群のゲノム構造は、T細胞受容体や免疫グロブリンのゲノム構造に類似した遺伝子クラスター構造を形成している。このことからCNR遺伝子多重欠損マウスの作製法としては各CNRの多様性を形成している可変領域2カ所にloxP配列を導入し、Cre-loxP系を用いてCNR可変領域を欠失させることによりおこなった。まず、1カ所目にloxP配列を導入したES細胞よりホモマウスが作製されている。また、loxPの導入されているES細胞に2カ所目のloxP配列を導入し2カ所にloxP配列が導入されているES細胞よりキメラマウスが3ライン作製されている。現在、ホモマウスの作製を行っており、今後、Creマウスとの掛け合わせにより、CNR遺伝子重欠損マウスを作製し、CNR分子多様性のマウス成体内における機能解析を行う。(2)各CNR蛋白質に対する特異抗体作製は、各CNRで多様性のあるEC2-3領域をGST融合蛋白質として作製し抗原に用いマウスモノクローナル抗体を作製した。また、各CNRで特異的なアミノ酸配列をKLH-ペプチド抗原として合成し抗原にもちい、ラットおよびウサギにおいてそれぞれモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製した。マウスモノクローナル抗体においては2種類の単一CNR特異認識抗体が得られている。また、ラットモノクローナル抗体においては5種類の単一CNR特異認識抗体が、ウサギポリクローナル抗体においては12種類の単一CNR特異認識抗体が得られた。これらの抗体を用いた成体マウス脳における免疫染色法での陽性細胞の局在様式は、各CNRに対する特異プローブを用いたin situハイブリダイゼーション法によるCNR mRNAの発現様式とほぼ同様であった。また、生後マウス脳における単一CNR特異抗体を用いた二重蛍光染色の結果、大脳皮質V層の神経細胞において異なる神経細胞にCNR蛋白質が発現していることが示された。今後、作製した各CNR特異抗体を用いて、マウス脳形成過程におけるCNR蛋白質の発現および局在様式の解析を行い、脳形成機構におけるCNR分子群の分子機能の解析を行う。

已经提出，CNR分子组充当与脑皮质形成机制相关的reelin分子的多重受体，并且CNR分子组的分子功能分析表明，揭示了脑皮质结构形成机制的一端。预计。在这项研究中，特别是为了阐明CNR分子组分子多样性的功能，（1）CNR基因多缺乏小鼠的制备和分析，（2）CNR分子多样性由CNR特定于特异性的CNR分子多样性抗体。（1）CNR分子组的基因组结构形成了类似于T细胞受体和免疫球蛋白的基因组结构的遗传簇结构。因此，作为产生CNR基因多重缺陷小鼠的一种方法，在两个可变区域中引入了LOXP序列，以形成每个CNR的多样性，而Cre-loxp系统则丢失以丢失CNR变量区域。首先，首先是由ES单元引入LOXP序列的HOMO小鼠。此外，LOXP引入的ES细胞在ES细胞中具有第二个LOXP序列，并且来自在两个地方引入LOXP序列的ES细胞产生了三个嵌合小鼠。当前，正在产生HOMO小鼠，将来，将通过繁殖CRE小鼠产生CNR基因缺陷小鼠，并在具有CNR分子多样性的小鼠小鼠中进行功能分析。（2）每种CNR中产生每种CNR蛋白的特殊抗体，每个CNR中的EC2-3区域都以GST融合蛋白的形式产生，并且在抗原中使用小鼠单色抗体。另外，将每个CNR合成为KLH肽抗原，并在大鼠和兔子中的单克隆和多克隆抗体中产生抗原和兔子。在小鼠单克隆抗体中，获得了两种类型的单一CNR特异性识别抗体。此外，在大鼠单克隆抗体中获得了五种类型的单一CNR特异性识别抗体，并在兔多克隆抗体中获得了12种类型的单CNR特异性识别抗体。使用这些抗体在成年小鼠脑中免疫仪法中阳性细胞的局部格式几乎与使用原位杂交方法的CNR mRNA的表达方式相同，并使用每种CNR的特殊探针。此外，由于双荧光染色使用了尾尾小鼠脑中的单个CNR特异性抗体，因此表明CNR蛋白在大脑皮层V层的神经细胞中的不同神经细胞中表达。将来，将使用创建的CNR特异性抗体，将分析CNR蛋白在小鼠脑形成过程中的表达和局部样式的分析，并且将分析CNR分子组在大脑形成机制中的分子功能。