ファイトケラチン合成酵素の構造及び機能解析

植物螯合素合酶的结构和功能分析

基本信息

批准号：
13033031
负责人：
日び隆雄
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Fukui Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

植物においては、メタロチオネインの一種ファイトケラチンが重金属に対する生体防御の中心的な役割を果たしている。ファイトケラチンの合成を司どるファイトケラチン合成酵素(PCS)は、細胞内の重金属濃度に応じて活性化されることから、重金属濃度を感知する「センサー能」を持つと推定されている。本研究ではPCSの触媒機構ならびに活性化機構の解明を目標としており、今年度は発現系の改善を行うとともに、重金属センサーと予想されるC末端領域を系統的に欠損させた変異型PCSの作製および機能解析を行った。昨年度までに、蛋白質の構造形成に関わる分子シャペロン量を増加させた発現系で、PCSの可溶化発現を改善できることを示した。本年度は引き続き、PCSの大量調製を試みたが、プロテアーゼによる分解のためか、構造解析に必要な可溶性産物の供給が困難なことが判明した。そこで、プロテアーゼ遺伝子を欠損させた大腸菌宿主での発現を検討したところ、細胞質プロテアーゼLon、ClpP、HslUの3つを欠損させたW3110D Lon、ClpP、HslUにおいて、PCSの発現量が野生株W3110に比して10倍以上と、飛躍的に改善されることを確認した。次いで、重金属センサーとして機能すると予想されるPCSC末端を系統的に欠損させた変異体8種類(PCSΔC1,PCSΔC2,PCSΔC3,PCSΔC4,PCSΔC5,PCSΔC6,PCSΔC7,PCSΔC8)を作製し、W3110D Lon、ClpP、HslUにおける発現を確認した。C末端領域を全て欠損し、ファイトケラチン合成ドメインのみを持つ変異体(PCSΔC8)過剰発現株は、全長型PCS過剰発現株と同様にカドミウム耐性を獲得したことから、PCSΔC8にもファイトケラチン合成活性があると示唆された。PCS活性化におけるC末端領域の機能解析は今後の課題てある。一方、不溶性産物を形成しやすいPCS全長型と同様に、PCSΔC8も不溶化しやすいことが分かり、構造解析に適した試料調製のために、分子シャペロンを用いたPCSΔC8の可溶化、および蛋白質工学的手法によるPCSΔC8のフォールディング能の改善が、今後引き続き検討すべき課題であると考えている。

在植物中，一种金属尼亚的战斗角蛋白在针对重金属的生物防御中起着核心作用。控制角蛋白合成酶（PCS）控制着战斗角蛋白的合成，被认为具有“传感器能力”，可以感觉到重金属浓度，因为它根据细胞中的重金属浓度被激活。在这项研究中，目标是阐明PC的催化剂机制和激活机制，今年我们将改善表达系统，并创建一个系统缺陷预期的C末端区域和功能分析的突变体PC。到去年，据表明，增加了与蛋白质结构形成相关的分子冠蛋白量的表达可以改善PC的溶解度表达。今年，我们继续准备大量的PC，但是发现很难提供结构分析所需的可溶产品，这可能是由于蛋白酶分解。因此，在检查缺乏蛋白酶基因的大细菌INN的表达时，将PCS表达的量与W3110D LON，CLPP和HSLU中的野生库存W3110进行了比较，而W3110D LON，CLPP和HSLU缺失了细胞质蛋白酶LON，CLPP和HSLU。我确认它将超过10倍以上。 PCSC末端を系统的に欠损させた変异体8种类（PCSΔC1，PCSΔC2，PCSΔC3，PCSΔC4，PCSΔC5，PCSΔC6，PCSΔC7，PCSΔC7）を作制し、W3110D LON lon、clpp clpp，hslu我确认了表达。 C突变体（PCSΔC8）仅具有FITE角蛋白合成结构域（PCSΔC8）的过量菌株获得了镉的耐药性，因此PCSΔC8也具有战斗角蛋白合成活性。 PCS激活中C末端区域的功能分析存在未来问题。另一方面，与全长类型的PC一样（易于形成不溶性产品），PCSΔC8也很容易插入不溶性，并且为了准备适合结构分析的样品，PC的解决方案，使用分子伴侣和蛋白质工程方法的ΔC8。