ファイトケラチン合成酵素の構造及び機能解析

植物螯合素合酶的结构和功能分析

基本信息

批准号：
13033031
负责人：
日び隆雄
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Fukui Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

植物においては、メタロチオネインの一種ファイトケラチンが重金属に対する生体防御の中心的な役割を果たしている。ファイトケラチンの合成を司どるファイトケラチン合成酵素(PCS)は、細胞内の重金属濃度に応じて活性化されることから、重金属濃度を感知する「センサー能」を持つと推定されている。本研究ではPCSの触媒機構ならびに活性化機構の解明を目標としており、今年度は発現系の改善を行うとともに、重金属センサーと予想されるC末端領域を系統的に欠損させた変異型PCSの作製および機能解析を行った。昨年度までに、蛋白質の構造形成に関わる分子シャペロン量を増加させた発現系で、PCSの可溶化発現を改善できることを示した。本年度は引き続き、PCSの大量調製を試みたが、プロテアーゼによる分解のためか、構造解析に必要な可溶性産物の供給が困難なことが判明した。そこで、プロテアーゼ遺伝子を欠損させた大腸菌宿主での発現を検討したところ、細胞質プロテアーゼLon、ClpP、HslUの3つを欠損させたW3110D Lon、ClpP、HslUにおいて、PCSの発現量が野生株W3110に比して10倍以上と、飛躍的に改善されることを確認した。次いで、重金属センサーとして機能すると予想されるPCSC末端を系統的に欠損させた変異体8種類(PCSΔC1,PCSΔC2,PCSΔC3,PCSΔC4,PCSΔC5,PCSΔC6,PCSΔC7,PCSΔC8)を作製し、W3110D Lon、ClpP、HslUにおける発現を確認した。C末端領域を全て欠損し、ファイトケラチン合成ドメインのみを持つ変異体(PCSΔC8)過剰発現株は、全長型PCS過剰発現株と同様にカドミウム耐性を獲得したことから、PCSΔC8にもファイトケラチン合成活性があると示唆された。PCS活性化におけるC末端領域の機能解析は今後の課題てある。一方、不溶性産物を形成しやすいPCS全長型と同様に、PCSΔC8も不溶化しやすいことが分かり、構造解析に適した試料調製のために、分子シャペロンを用いたPCSΔC8の可溶化、および蛋白質工学的手法によるPCSΔC8のフォールディング能の改善が、今後引き続き検討すべき課題であると考えている。

在植物中，一种金属硫蛋白的植物角蛋白在对重金属的生物保护中起着核心作用。根据细胞中重金属的浓度而激活了控制植物素的合成的植物角蛋白合酶（PCS），据估计具有“传感器能力”感知重金属浓度。这项研究旨在阐明PC的催化和激活机制，今年我们改善了表达系统，我们还对突变体PC进行了生产和功能分析，突变体PC在重金属传感器和预期的C末端区域中系统地缺乏。到去年，据表明，参与蛋白质结构的分子伴侣量增加的表达系统可以改善PC的溶解度表达。尽管我们今年继续尝试准备大量PC，但发现很难提供结构分析所需的可溶产品，这可能是由于蛋白酶的降解所致。 Therefore, when we investigated the expression in E. coli hosts that had a defective protease gene, we confirmed that PCS expression levels were dramatically improved in W3110D Lon, ClpP, and HslU, which had deficient in three cytoplasmic proteases Lon, ClpP, and HslU, which had a defective cytoplasmic protease Lon, ClpP, and HslU, which had a significantly improved level of PCS expression与野生应变W3110相比，水平超过10倍。接下来，产生了八个突变体（PCSΔC1，PCSΔC2，PCSΔC3，PCSΔC4，PCSΔC5，PCSΔC6，PCSΔC7，PCSΔC7，PCSΔC8）在PCSC终端系统上系统地缺陷，预计将在重金属传感器中起作用，并在W3110D LON，CLPP，Clpp，Clpp和Hslu中表达。缺乏所有C末端区域的突变体（PCSΔC8）的过度表达应变，并且仅具有植物素的合成结构域（PCSΔC8）实现了类似于PCSΔC8的全长PCS菌株类似的镉抗性，这也表明PCSΔC8也具有植物素的合成活性。 PCS激活过程中C末端区域的功能分析是未来的挑战。另一方面，发现PCSΔC8很容易不溶，就像全长PCS类型一样，容易形成不溶性产品，我们相信，使用分子伴侣的PCSΔC8溶解并提高PCSΔC8使用PCSΔC8使用Protein Engineering方法可以继续进行分析，以便在未来的分析中进行分析。