ヒト人工染色体を用いたセントロメアの高次調節機構の解析

利用人类人工染色体分析着丝粒的高阶调控机制

• 批准号: 11239202
• 负责人: 舛本 寛
• 金额: $ 41.98万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11239202/
• 关键词: セントロメア; 人工染色体; アルフォイドDNA; CENP-A; CENP-B; ヘテロクロマチン; サイレント化; エピジェネティックス; テロメア; 酵母人工染色体(YAC); ヒト人工染色体

本代表者らは、ヒト培養細胞中で人工染色体を高い頻度で形成させる系を開発した。この系を用いセントロメア由来アルフォイドDNA配列のCENP-B結合能に依存して、セントロメア構造形成に必須なCENP-Aクロマチンの集合が起こることを明らかにしている。さらに、人工染色体上の薬剤耐性遺伝子からの転写活性は人工染色体形成効率に大きな影響を与えることが解ってきた。そこで本研究では、転写とセントロメア機能との関連性や基本的な染色体機能装置相互間の高次調節機構を解明することを目的として、(1)セントロメア形成に必須な要素、(2)セントロメア形成に伴うクロマチン構造、(3)セントロメア不活性化とヘテロクロマチン化、に関する研究を進めた。人工染色体形成能とクロマチン免疫沈殿法を用いた解析の結果、(1)マウス細胞でもCENP-B/CENP-B boxの存在に依存して、新規CENP-Aクロマチン形成が起こること。(2)CENP-BとCENP-Cは直接相互作用すること。さらにCENP-Bと相互作用する新規クロマチンリモデリング因子が単離されてくること。(3)人工染色体上ではアルフォイド配列に隣接する薬剤耐性遺伝子は転写され、この開いたクロマチンに依存してCENP-Aクロマチンが集合すること。この領域のクロマチンがヘテロクロマチン化されることによってセントロメア機能は不活性化すること。逆に耐性遺伝子の転写活性化やTSAによるとヒストンの高アセチル化は、アルフォイド配列や隣接する薬剤耐性遺伝子のクロマチン構造を開き、不活性化アルフォイド配列上にCENP-Aを含むセントロメア・クロマチンの再形成(再活性化)を誘導できること、等を明らかにした。染色体の安定分配にはセントロメア・キネトコアとともに染色分体を接着させるヘテロクロマチン領域も必要であり、人工染色体上での両クロマチン構造のバランスをうまく保つことが今後の課題である。

目前的代表已经开发出一种系统，该系统允许人工染色体在培养的人类细胞中高频率地形成。使用该系统，我们证明了对着丝粒结构形成至关重要的CENP-A染色质的组装取决于着丝粒衍生的αDNA序列的CENP-B结合能力。此外，已发现人工染色体上耐药基因的转录活性对人工染色体形成的效率具有显着影响。因此，在本研究中，我们旨在阐明转录与着丝粒功能之间的关系以及基本染色体功能装置之间的高级调控机制，我们对与（3）着丝粒失活和异染色质化相关的染色质结构进行了研究。利用形成人工染色体和染色质免疫沉淀的能力进行分析，我们发现：（1）即使在小鼠细胞中也会出现新的CENP-A染色质形成，这取决于CENP-B/CENP-B盒的存在； (2)CENP-B和CENP-C直接相互作用。此外，将分离出与 CENP-B 相互作用的新型染色质重塑因子。 (3)在人工染色体上，与α基因序列相邻的耐药基因被转录，CENP-A染色质依赖于这个开放的染色质进行组装。着丝粒功能因该区域染色质的异染色质化而失活。相反，TSA对抗性基因的转录激活和组蛋白的过度乙酰化打开了α基因序列和邻近耐药基因的染色质结构，导致失活的α基因序列上含有CENP-A的着丝粒染色质的再生（重新激活）。 ) 可以被诱导。染色体的稳定分离需要着丝粒和动粒以及粘附染色单体的异染色质区域，未来的挑战将包括在人工染色体上的两种染色质结构之间保持良好的平衡。

项目成果

M.Nakano: "Epigenetic assembly of centromeric chromatin at ectopic a-satellite sites on human chromosomes"J.Cell Science. 116. 4021-4034 (2003)

M.Nakano：“着丝粒染色质在人类染色体异位α卫星位点的表观遗传组装”J.Cell Science。

T.Hayakawa: "Cell cycle behavior of human HP1 subtypes : distinct molecular domains of HP1 are required for their centromeric localization during interphase and metaphase"J.Cell Science. 116. 3327-3338 (2003)

T.Hayakawa：“人类 HP1 亚型的细胞周期行为：HP1 的不同分子结构域是间期和中期着丝粒定位所必需的”J.Cell Science。

舛本寛: "機能するセントロメアはどこで作られるか?"細胞工学. 18,7. 955-962 (1999)

Hiroshi Masumoto：“功能性着丝粒是在哪里产生的？”18,7（1999）。

中野めぐみ,舛本寛: "ヒト人工染色体"現代医療. 32. 158-164 (2000)

Megumi Nakano，Hiroshi Masumoto：“人类人工染色体” 现代医学 32. 158-164 (2000)。

J.Ohzeki: "CENP-B box is required for de novo centromere chromatin assembly on human alphoid DNA"J.Cell Biol.. 159. 765-775 (2002)

J.Ohzeki：“在人类 alpoid DNA 上从头着丝粒染色质组装需要 CENP-B 盒”J.Cell Biol.. 159. 765-775 (2002)