mRNAの核外輸送機構に関する研究

mRNA核输出机制研究

基本信息

批准号：
11237206
负责人：
谷時雄
金额：
$ 41.28万
依托单位：
Kumamoto University (2001-2003)Kyushu University (1999-2000)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1.分裂酵母のmRNA核外輸送温度感受性変異株ptr5とptr9の原因遺伝子をクローニングし、解析を行った。その結果、ptr5^+遺伝子がコードする蛋白質は核膜孔因子Nup85pの分裂酵母ホモログであることが示された。ptr5変異株では蛋白質の核内外輸送は正常であったことから、Ptr5pはmRNA核外輸送特異的に機能する核膜孔因子であることが示唆された。また、ptr9遺伝子は紡錘極体(SPB)形成に関与するSfilpと同一であった。ptr9変異株では、細胞形態の異常が観察されることから、細胞周期進行の制御とmRNA核外輸送機構との間に何らかの関連がある可能性が示唆された。2.ヒトの手足形成不全を伴う遺伝性疾患split hand/split foot病の原因遺伝子DSS1の分裂酵母相同遺伝子を欠失させると、mRNAの核外輸送に異常を示すことを昨年度までに明らかにした。今回新たにdss1欠失株のマルチコピーサプレッサーとして、プロテアソームの構成因子であるPadlpを同定した。この結果から、DSS1がプロテアソームを介して機能していることが判明した。3.蛍光標識したftz pre-mRNAをHeLa細胞核にマイクロインジェクションしたところ、蛍光pre-mRNAは核内でSC35のスペックルと共局在してスプライシングされた後に、細胞質へと核外輸送された。イントロンを含まないcDNA由来のmRNAに比較して、pre-mRNAの方が迅速に細胞質へと輸送され、スプライシング反応が核外輸送を促進することが示された。RT-PCRを用いて蛍光mRNAが細胞内で分解されていないこと、また、転写阻害によってmRNA核外輸送が阻害されること、その際輸送されなかった蛍光mRNAが核内の新規ドメインTIDRに蓄積することを明らかにした。本実験系は、唯一のmRNA核外輸送の可視化アッセイ系として今後有用であると思われる。

1.我们克隆并分析了裂殖酵母mRNA输出中负责温度敏感突变体ptr5和ptr9的基因。结果表明，ptr5^+基因编码的蛋白是核孔因子Nup85p的裂殖酵母同源物。在ptr5突变体中，蛋白质进出细胞核的转运是正常的，这表明Ptr5p是一种核孔因子，专门针对mRNA核输出发挥作用。此外，ptr9 基因与 Sfilp 相同，后者参与纺锤体极体 (SPB) 的形成。在ptr9突变体中观察到异常的细胞形态，表明细胞周期进程的控制与mRNA输出机制之间可能存在某种关系。 2.去年，我们发现裂殖酵母的 DSS1 同源基因（该基因负责裂手/裂脚病，一种与人类肢体发育不全相关的遗传病）的缺失，会导致 mRNA 的核输出异常。在这项研究中，我们新鉴定了 Padlp（蛋白酶体的一个组成部分）作为 dss1 缺失菌株的多拷贝抑制子。这些结果表明 DSS1 通过蛋白酶体发挥作用。 3.当荧光标记的ftz pre-mRNA显微注射到HeLa细胞核中时，荧光pre-mRNA与细胞核中的SC35斑点共定位，被剪接，然后输出到细胞质。与不含内含子的 cDNA 衍生的 mRNA 相比，前 mRNA 被更快地转运到细胞质，表明剪接反应促进了核输出。使用 RT-PCR，我们发现荧光 mRNA 在细胞内不会被降解，并且转录抑制会抑制 mRNA 核输出，并且未转运的荧光 mRNA 会在细胞核中的新结构域 TIDR 中积累。该实验系统预计将在未来作为唯一的 mRNA 核输出可视化分析系统发挥作用。