植物生活環の中での液胞膜輸送ネットワークの機能調節

植物生命周期中液泡膜运输网络的功能调节

基本信息

批准号：
10219203
负责人：
山木昭平
金额：
$ 91.46万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

液胞膜タンパクのカタログ化シロイヌナズナ緑色植物体から液胞膜濃縮画分を調製し、強膜結合タンパク質に対するプロテオーム解析を行った結果、96個の遺伝子が特定された。これらの分子の正確な細胞内局在と機能解析を行うために、約50分子に対する抗ペプチド抗体を作製した。自らの研究に使用するだけでなく、抗体を膜タンパク質研究者の実験ツールをして広く利用してもらうために、作製した抗体の検定を詳細に行っている。すなわち、抗体の特異性をELISA,生体膜試料との反応性、抗原ペプチドとの競合、抗体の使用濃度による反応性の変化などで検定している。一部の分子は既に抗体をオルガネラ膜分画に反応させ細胞内局在を調べた。その結果、液胞膜、細胞膜および小胞体膜に局在する分子が特定された。液胞膜Ca^<2+>/H^+対向輸送体植物液胞へのCa^<2+>、Cd^<2+>、Mg^<2+>、Mn^<2+>等の金属イオン集積機構を解明するために、イネ液胞膜Ca^<2+>/H^+対向輸送体の5種(OsCAX1a,1b,1c,2,3)をcDNAクローニングした。いずれも411〜453個のアミノ酸で構成され11個の膜貫通推定領域をもつ。機能検定をするため、酵母に個々の遺伝子を導入し発現させ、各種イオン耐性を検定した。その結果、Ca^<2+>のみを輸送する分子種、Mn^<2+>とCa^<2+>の両方を輸送する分子種があることが明らかになった。さらに、イオン選択性を司る機能ドメインについて、部位特異的変異導入法により、分子内繰り返し配列内のアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン残基が必須であることが明らかにされ、それらの膜内配置も検定した。ダイコン水チャネルの水輸送機能の解析ダイコンの液胞膜水チャネルの機能を検定するために、その遺伝子を酵母に導入して膜を調製し、ストップドフロー法で膜の水透過率を測定した。その結果、液胞膜型2種での水輸送活性を検出することができた。

液泡膜蛋白的编目我们从拟南芥绿色植物中制备了富含液泡膜的级分，并对巩膜结合蛋白进行了蛋白质组分析，结果鉴定出了 96 个基因。为了准确分析这些分子的细胞内定位和功能，我们生成了针对大约 50 个分子的抗肽抗体。除了在我们自己的研究中使用抗体外，我们还对我们生产的抗体进行了详细的分析，以便它们可以广泛用作膜蛋白研究人员的实验工具。即，使用ELISA来测试抗体的特异性、与生物膜样品的反应性、与抗原肽的竞争以及根据所用抗体的浓度而改变的反应性。我们已经通过抗体与细胞器膜组分反应研究了一些分子的细胞内定位。结果，鉴定出位于液泡膜、细胞膜和内质网膜中的分子。液泡膜 Ca^<2+>/H^+ 将 Ca^<2+>、Cd^<2+>、Mg^<2+>、Mn^<2+> 等反向转运至植物液泡为了阐明金属离子积累机制，我们克隆了5种水稻液泡膜Ca^2+/H^+逆向转运蛋白（OsCAX1a、1b、1c、2和3）的cDNA。全部由 411 至 453 个氨基酸组成，并具有 11 个假定的跨膜区域。为了测试其功能，我们将每个基因引入酵母中，进行表达，并测试其对各种离子的抵抗力。结果表明，存在仅传输Ca^<2+>的分子种类和同时传输Mn^<2+>和Ca^<2+>的分子种类。此外，定点诱变揭示分子内重复序列中的天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸残基对于控制离子选择性的功能结构域至关重要，并且还测试了它们的膜内排列。萝卜水通道的水分运输功能分析为了测试萝卜液泡膜水通道的功能，将基因导入酵母中制备膜，采用停流法测定膜的透水性.结果，我们能够检测两种液泡膜类型的水运输活动。