線虫Caenorhabditis elegansを用いた休眠打破機構の解明

利用线虫秀丽隐杆线虫阐明休眠打破机制

基本信息

批准号：
09265216
负责人：
河野強
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Tottori University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09265216/
关键词：
nematode C.elegans diapause gene expression cloning

项目摘要

線虫Caenorhabditis elegansの生活環には「耐性幼虫形成」と呼ばれる現象が知られている。これは、生存に不利な環境に応答して一時的に生育を停止する現象であり、昆虫類の幼虫休眠と類似している。本研究の目的は、線虫C.elegansのいわゆる“休眠"が打破される機構を解明することにより昆虫類にも共通する重要な知見を得ることである。そこで本研究では、まず、耐性幼虫打破前後での動的変動を遺伝子レベルで解析することにした。C.elegansをegg plate法で大量調製し、食餌(大腸菌)が枯渇した状態に放置することにより耐性幼虫を形成させた。次いで、耐性幼虫の一部を食餌を十分に含んだ液体培地に移し、1時間、3時間および12時間振盪培養を行った。それぞれの線虫よりmRNAを調製し、differnetial display法をを用いて遺伝子発現パターンの差違を検出した。次いで、時期特異的に発現するバンドの塩基配列分析を行い、C.elegansのゲノムプロジェクト情報を検索した。次いで、RACE法を用いて全長cDNAの構造を明らかにした。さらに、ゲノムDNAの構造を推定した。differential displayによる発現パターン解析の結果、耐性幼虫においては、おおむね遺伝子発現が抑制されており、耐性幼虫打破の亢進に伴い、時期特異的な遺伝子発現が認められた。今回解析したクローンのうち、1時間後に特異的に発現する遺伝子は、リボゾームタンパクをコードしていたが、スプライシング制御に関わるSWAP遺伝子と連動する可能性が示唆され、興味深い。また、12時間後に特異的に発現する遺伝子は414アミノ酸残基よりなる新規タンパクをコードしていた。これは、他のタンパクと有意な相同性を示さず、機能は不明である。

在线虫的生命周期中存在一种称为“抗性幼虫形成”的现象。这是一种因环境不利于生存而暂时停止生长的现象，类似于昆虫幼虫滞育。这项研究的目的是阐明线虫“休眠”被打破的机制，从而获得昆虫共有的重要知识。因此，在本研究中，我们首先决定分析抗性幼虫突破前后在基因水平上的动态变化。使用蛋盘法大量制备秀丽隐杆线虫，并通过将其置于食物（大肠杆菌）耗尽的状态来形成抗性幼虫。然后将一部分抗性幼虫转移至含有足够食物的液体培养基中并振荡培养1、3和12小时。从每种线虫中制备mRNA，并使用差异显示方法检测基因表达模式的差异。接下来，我们对以时间特异性方式表达的条带进行核苷酸序列分析，并搜索秀丽隐杆线虫基因组计划信息。接下来，使用RACE方法揭示了全长cDNA的结构。此外，还估计了基因组DNA的结构。使用差异显示进行表达模式分析的结果是，抗性幼虫中的基因表达普遍受到抑制，并且随着抗性幼虫突破的进展，观察到阶段特异性基因表达。在这次分析的克隆中，1小时后特异性表达的基因编码了一种核糖体蛋白，这很有趣，因为它表明它可能与参与剪接控制的SWAP基因有关。此外，12小时后特异性表达的基因编码了一种由414个氨基酸残基组成的新蛋白质。它与其他蛋白质没有显着的同源性，其功能未知。