マウス始原生殖細胞発生過程の分子遺伝学的解析

小鼠原始生殖细胞发育的分子遗传学分析

基本信息

批准号：
09264218
负责人：
阿部訓也
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09264218/
关键词：
始原生殖細胞 cDNA マウス FACS

项目摘要

[目的]生物を構成する細胞の中で生殖細胞は唯一、次世代に受け継がれると言う意味で不死であり、また全能性を有するという点で、非可逆的な分化を行う体細胞とは大きく異なり、また始原生殖細胞(PGC)は生殖系列の成立、維持の機構を考える上で非常に重要な細胞である.しかし、PGCというごく少数の細胞を単離し、直接分子レベルの解析対象とするのは通常の手法では大変困難であった.そこでそのために必要な諸技術を開発し、生殖系列発生の各ステージでどのような遺伝子が発現するかという基本的知見を得ることを第一義的な目標とする.[成果]PGCのマーカーであるアルカリフォスファターゼ遺伝子をlacZ遺伝子で置換したTNAP(組織非特異型アルカリフォスファターゼ)ノックアウトマウスを用い、lacZ発現を指標としてPGCを分離、純化するFACS-gal法を確立し、胎生11.5-15.5日からのPGCの純化に成功した.このPGCを利用することにより、テロメラーゼ活性の測定やPGCゲノムDNAのメチル化状態等を直接調べることが可能になりPGCという細胞の特質解明の糸口をつかむことができた.またPGCよりRNAを抽出してcDNAを合成し、ローンリンカー法によりcDNA集団の増幅を行った.このcDNAを材料に既知遺伝子のPGCでの発現を調べることが可能になった.さらにこのcDNAを用いてライブラリー作製を行った.これらのライブラリーはPGCにおける遺伝子発現プロファイルを解析、記述するために有用と考えられる.その解析の一端としてこれまで13.5日胚の雌雄のPGCそれぞれのライブラリーから4000クローンをピックアップし、2800クローンの配列決定を行なった.このうち有効な配列情報の得られた1555クローンに関してホモロジー検索を行った.その多くはESTクローンを含め既知の遺伝子と相同性を示した.また雌雄で出現頻度に差異のあるクローンも複数認められた.

[目的] 在组成生物体的细胞中，生殖细胞是唯一具有永生性的细胞，可以遗传给下一代，并且具有全能性，这与进行不可逆分化的体细胞有显着不同。原始生殖细胞（PGC）与生殖系不同。在考虑它们的建立和维持机制时，这些细胞极其重要。然而，分离少量称为 PGC 的细胞并使用常规方法直接在分子水平上分析它们是极其困难的。必要的技术和我们的主要目标是获得关于谱系发育的每个阶段表达哪些基因的基本知识。 [结果] TNAP (TNAP)，其中碱性磷酸酶基因（PGC 标记）被 lacZ 基因取代。以非典型碱性磷酸酶基因敲除小鼠为对象，以lacZ表达为指标，建立FACS-gal方法分离纯化PGCs，并成功纯化胚胎11.5~15.5天的PGCs。这使得测量端粒酶活性并直接研究PGC基因组DNA的甲基化状态成为可能，为阐明PGC细胞的特征提供了线索。此外，还从PGC中提取了RNA并合成了cDNA。使用连接子方法扩增cDNA群体，可以研究PGC中已知基因的表达。此外，该cDNA用于构建PGC文库。它被认为对于分析和描述基因表达谱很有用。作为该分析的一部分，我们迄今为止已从 13.5 天胚胎的雄性和雌性 PGC 文库中挑选了 4000 个克隆，并对 2800 个克隆进行了测序。对1555个克隆进行了同源性搜索，获得了有效的序列信息。其中许多克隆与已知基因具有同源性，其中包括EST克隆。还发现了在男性和女性之间出现频率不同的克隆。