クロマチン構造を介した組換え反応の機能解析

染色质结构介导的重组反应的功能分析

基本信息

批准号：
09263219
负责人：
太田力
金额：
$ 1.28万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09263219/
关键词：
クロマチン Mre11タンパク組換え

项目摘要

酵母の遺伝学的研究から相同組換えの最初の反応である二本鎖DNAの切断に関与すると考えられているMRE11遺伝子のアミノ末端にflag-tag(Asp-Tyr-Lye-Asp-Asp-Asp-Asp-Lyeの8個のアミノ酸)を付けたものを酵母で発現させflag-tagに対する抗体カラムを用いてMRE11蛋白質複合体を精製することに成功した。精製したMRE11蛋白質画分にはRAD50蛋白質も含まれていた。これはMRE11蛋白質とRAD50蛋白質が酵母の細胞内で蛋白質複合体を形成することを示唆したものである。このMRE11蛋白質複合体は一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの切断活性を持つことが分かった。次に、MRE11蛋白質を大腸菌を用いて大量発現させNiアガロース、GSTセファロース、dsDNAセルロース、MonoS(FPLC)を用いて精製した。120kdの単一の蛋白質を得ることができた。MRE11蛋白質の抗体をもちいたwestern法でMonos画分をアッセイしたところ120kdのバンドが検出された。従って、この120kdの蛋白質はMRE11蛋白質であると思われる。精製したMRE11蛋白質は一本鎖DNA切断活性を持つことが分かった。平成10年度はこのMRE11蛋白質複合体の大量精製を行い、含まれる蛋白質の同定と生化学的解析を行うつもりである。精製したに組換えに関与する蛋白質複合体のなかには、今まで知られていない蛋白質の存在が予想される。そこで未知の蛋白質の機能を調べるためにその遺伝子のクローニングを行う。次に、得られたcDNAあるいはgenomicDNAを用いてその遺伝子の変異株を酵母で作成しin vivoでの機能を調べることを計画している。

基于酵母遗传学研究，在酵母中表达了flag-tag（Asp-Tyr-Lye-Asp-Asp-Asp -Asp-Lye（8个氨基酸）），并使用针对flag的抗体柱成功纯化了MRE11蛋白复合物-标签。纯化的MRE11蛋白级分还含有RAD50蛋白。这表明 MRE11 蛋白和 RAD50 蛋白在酵母细胞内形成蛋白复合物。人们发现这种 MRE11 蛋白复合物具有单链 DNA 和双链 DNA 切割活性。接下来，使用大肠杆菌大量表达 MRE11 蛋白，并使用 Ni 琼脂糖、GST Sepharose、dsDNA 纤维素和 MonoS (FPLC) 进行纯化。我们能够获得120kd的单一蛋白质。当使用针对 MRE11 蛋白的抗体通过 Western 方法测定 Monos 级分时，检测到 120 kd 条带。因此，这个120kd的蛋白被认为是MRE11蛋白。纯化的MRE11蛋白被发现具有单链DNA切割活性。 1998年，我们计划大量纯化这种MRE11蛋白复合物，鉴定其中所含的蛋白，并进行生化分析。在涉及重组的纯化蛋白质复合物中，预计可能存在迄今为止未知的蛋白质。因此，为了研究未知蛋白质的功能，我们将克隆该基因。接下来，我们计划利用获得的cDNA或基因组DNA在酵母中创建该基因的突变株并研究其在体内的功能。