耐熱性リンゴ酸脱水素酵素のドメインの折れたたみ機構に関する研究

耐热苹果酸脱氢酶结构域折叠机制研究

• 批准号: 09261204
• 负责人: 西山 真
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09261204/
• 关键词: リンゴ酸脱水素酵素; 耐熱性酵素; フォールディング; 蛋白質工学

本研究では耐熱性リンゴ酸脱水素酵素tMDHを用いて、タンパク質内部の疎水性コアがタンパク質の安定性に及ぼす影響を調べるとともに、酵素の構成単位であるドメインの折り畳みとその安定性を調べることで、耐熱性タンパク質の安定性と折り畳み機構に関する知見を得ることを目的に研究を行った。tMDHはN末側のNAD結合ドメイン(1-154aa)とC末側の触媒ドメイン(155-327aa)に分けられることから、サブユニット境界で両ドメインを分断した分断化tMDHを作製することとした。この分断酵素は、基本的に野生型酵素と同様な酵素活性を示す正確に折り畳まれた4量体酵素として生産されした。しかしながら、サブユニット境界は分子内部にあることより、耐熱性は20℃近くも低下し、塩酸グアニジンに対する変性濃度も4M程度低下した。精製酵素を変性剤存在下で陰イオン交換に供することにより、両ドメインを分離することに成功した。分離した溶液から変性剤を希釈することにより、両ドメインのフォールディングを行わせ、その構造の回復をCDで追跡したところ、両ドメインともに速やかに2次構造を形成することが明らかとなった。両者のCDスペクトルの和は、変性剤を含まないものの80%程度のCDの値を示したことから、両ドメインは基本的には自律的にフォールディングすることが示唆された。次に、分子内部の疎水性コア部分のパッキングに着目し、2つの新規なプログラム(最適なパッキングを生じさせるアミノ酸配列を与えるプログラム並びに安定性に関する熱力学的パラメーターをを予測するプログラム)を開発し、その結果を実験的に検証することとした。tMDHと中温菌である大腸菌のMDHの同一疎水性コアにこのプログラムを適用し、その安定性の変化の予測が、実際の実験の結果と半定量的に一致することが確かめられた。また、大腸菌のものはパッキングにまだゆとりがあること、tMDHではすでにほぼ理想的にパッキングされていることも明らかになった。さらに、天然状態のパッキングのエネルギーと変性状態の水和及び側鎖エントロピーを考慮した安定化ギプス自由エネルギーの予測法がこれまでのものより優れていることが明らかとなった。

在本研究中，我们使用耐热苹果酸脱氢酶 tMDH 来研究蛋白质内部疏水核心对蛋白质稳定性的影响，并研究该酶的结构单元结构域的折叠和稳定性。目的是获得有关热稳定蛋白质的稳定性和折叠机制的知识。由于 tMDH 分为 N 端 NAD 结合结构域 (1-154aa) 和 C 端催化结构域 (155-327aa)，因此我们决定创建片段化的 tMDH，其中两个结构域在亚基边界处分开。裂解酶被生产为正确折叠的四聚体酶，其酶活性与野生型酶基本相似。但由于亚基边界在分子内，耐热性下降了近20℃，盐酸胍的修饰浓度也下降了约4M。通过在变性剂存在下对纯化的酶进行阴离子交换，我们成功地分离了两个结构域。通过从分离的溶液中稀释变性剂，使两个结构域折叠，并且随后进行CD结构恢复，结果表明两个结构域快速形成二级结构。两个结构域的CD光谱之和显示CD值约为无变性剂情况下的80%，表明两个结构域基本上自主折叠。接下来，我们专注于分子内部疏水核心的堆积，并开发了两个新程序：一个给出产生最佳堆积的氨基酸序列，另一个预测与稳定性相关的热力学参数。实验结果。我们将该程序应用于嗜温细菌大肠杆菌的 tMDH 和 MDH 的相同疏水核心，并证实预测的稳定性变化与实际实验结果半定量一致。另据透露，大肠杆菌的包装仍有一定余地，tMDH 的包装已经近乎理想。此外，研究表明，预测稳定铸造自由能的方法考虑了自然状态下的堆积能和变性状态下的水合和侧链熵，优于以前的方法。

项目成果

H.Kono: "Design of hydrophobic core of Thermus flavus malate dehydrogenase based on the side-chain packing" Protein Eng.(in press). (1998)

H.Kono：“基于侧链包装的黄栖热菌苹果酸脱氢酶疏水核心的设计”Protein Eng.（出版中）。

H.Kono: "Design of hydrophobic core of E.coli malate dehydrogenase based on the side-chain packing" Pac.Symp.Biocomput.210-221 (1997)

H.Kono：“基于侧链包装的大肠杆菌苹果酸脱氢酶疏水核心的设计”Pac.Symp.Biocomput.210-221 (1997)