イオン駆動型トランスポーターの構造と機能に関する比較研究

离子驱动转运蛋白结构与功能的比较研究

基本信息

批准号：
08268250
负责人：
三木俊明
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ポリアミン輸送体、UDP-ガラクトース輸送体、Na^+/H^+アンチポーターについて次の研究成果を得た。1.UDP-ガラクトース輸送体(UGT)のクローニングと解析:マウスFM3A細胞の変異株Had-1細胞は、UGTを欠損する。我々は、この欠損の相補を指標として、alternative splicingによる生じた2種類の異なるUGTのcDNAを単離することに成功した。その結果、UGT2には396アミノ酸残基のORFが存在するが388番目のLysまでの配列はUGT1,UGT2に共通であり、C末端部分の数残基および3'UTR部分の配列のみが両者で異なることが明らかになった。UGTcDNAの発現実験を行ったところ、UGT1,2をHad-2細胞に導入して得られたtransformantはいずれも、Had-1のUGT欠損が相補されていることが示された。UGT1,2のそれぞれに特異的なペプチド抗体を用いた解析から、Had-1細胞中にはUGT産物が検出されないこと、Had-1/UGT1細胞中にはUGT1産物、Had-1/UGT2細胞中にはUGT2産物がそれぞれ発現していること、親株FM3A細胞中には抗UGT2抗体と交叉反応を示すタンパク質が存在することがそれぞれ明らかになった。以上の結果に基づいて我々は、8回膜貫通型の推定構造をもつUGT1,UGT2はUDP-ガラクトース輸送体の本体であると結論した。2.ポリアミン輸送系の検討:メンブランフィルター上で培養し、側底膜と頂端膜に分化した単層シートを形成させた腎尿細管由来のLLC-PK_1細胞を用いて、ポリアミンの輸送系について検討を行った。遊離ポリアミンの取り込みに関して、この細胞は側底膜側にも1種類、頂端膜側には高親和性および低親和性の2種類のポリアミン輸送系にもつことが明らかになった。ポリアミンの取り込みに関する競合実験の結果は、これらの輸送体がいずれもポリアミンのうちプトレシン(Put),スペルミジン(Spd),スペルミン(Spm)を輸送する能力を持つことを示している。現在までのところこの細胞には、特定のポリアミン骨格に特異的な輸送体は見出されていない。原尿中のポリアミンの再吸収に関与すると考えられる頂端膜側のポリアミン輸送系の性質についてさらに検討した結果、モノアセチルスペルミンがSpdの取り込みと競合しつつ,Spd輸送系を経由して実際に細胞内に取り込まれることが示された。これに対してジアセチルスペルミンはSpdの取り込みと競合しないだけでなく、頂端膜側からは全く細胞内に取り込まれないことが明らかになった。3.Na^+/H^+アンチポーター(NHE):ウシ腎臓の上皮組織におけるNHEの局在性について、NHE1,NHE3isoformに対するペプチド抗体を用いて検討したところ、NHE1は側底膜に、NHE3は刷子縁膜に局在することが明らかになった。

关于多胺转运蛋白、UDP-半乳糖转运蛋白和Na^+/H^+反向转运蛋白获得了以下研究结果。 1.UDP-半乳糖转运蛋白(UGT)的克隆和分析：Had-1细胞是小鼠FM3A细胞的突变株，缺乏UGT。使用该缺陷的互补作为指标，我们成功地分离了通过选择性剪接产生的两种不同的UGT cDNA。结果，UGT2的ORF为396个氨基酸残基，但直到第388位Lys的序列是UGT1和UGT2共有的，只有C端部分的少数残基和3'UTR部分的序列是相同的。两者之间显然有些不同。 UGT cDNA表达实验表明，将UGT1和UGT2导入Had-2细胞中获得的所有转化子都补充了Had-1中UGT的缺陷。使用UGT1和2特异性肽抗体进行分析表明，在Had-1细胞中未检测到UGT产物，在Had-1/UGT1细胞中检测到UGT1产物，并且在Had-1/UGT2细胞中检测到UGT产物。 UGT2 产物在细胞中表达，并且亲本 FM3A 细胞含有与抗 UGT2 抗体发生交叉反应的蛋白质。基于上述结果，我们得出结论，具有预测的八跨膜结构的UGT1和UGT2是UDP-半乳糖转运蛋白的主体。 2.多胺转运系统的检查：使用在膜过滤器上培养的肾小管来源的LLC-PK_1细胞进行多胺转运系统的检查，以形成分化为基底外侧膜和顶膜的单层片。关于游离多胺的摄取，发现这些细胞在基底外侧膜侧具有一种多胺转运系统，在顶膜侧具有高亲和力和低亲和力两种多胺转运系统。关于多胺摄取的竞争实验结果表明，所有这些转运蛋白都具有在多胺之间转运腐胺（Put）、亚精胺（Spd）和精胺（Spm）的能力。迄今为止，在该细胞中尚未发现特定于特定多胺骨架的转运蛋白。对顶膜侧多胺转运系统特性的进一步研究表明，单乙酰精胺与 Spd 的摄取竞争，并实际上通过 Spd 转运系统进入细胞，该系统被认为参与原尿中多胺的重吸收。事实证明，它被纳入与此相对，可知二乙酰精胺不仅不与Spd的摄取竞争，而且根本不从顶膜侧被摄取到细胞内。 3.Na^+/H^+逆向转运蛋白（NHE）：使用针对NHE1和NHE3亚型的肽抗体研究了NHE在牛肾上皮组织中的定位，结果显示其定位于刷状缘膜中。。