IP_3誘導Ca^<2+>放出チャネルの構造・機能機関

IP_3诱导的Ca^<2+>释放通道的结构和功能

基本信息

批准号：
08268210
负责人：
古市貞一
金额：
$ 1.54万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.IP_3受容体のIP_3結合領域を大腸菌で発現させて、そのIP_3リガンド結合活性に関してアミノ酸レベルで解析した。N末端側の225〜578アミノ酸はIP_3結合の「コア領域」を形成し、この中でArg-265、LYs-508、Arg-511は必須の塩基性アミノ酸であることが解った。一方、N末端から224アミノ酸まではIP_3結合にむしろ阻害的に働くことを明らかにした。バキュロウイルスベクター/昆虫細胞系で、機能的なIP_3結合活性を持つヒトIP_3受容体を大量に発現させることに成功した。発現したIP_3受容体のIP_3結合親和性はCa^<2+>の影響を受け、タイプ1IP_3受容体とタイプ3IP_3受容体では全く逆のCa^<2+>濃度依存性を示した。タイプ1は、10nM以下の低濃度のCa^<2+>で高親和性で、Ca^<2+>濃度が高くなるにつれ徐々にIP_3結合活性が低下し、数μMで低親和性に至る、EC_<50>が100nMCa^<2+>のシグモイドカーブを示した。逆に、タイプ3は、100nM付近からそれ以下のCa^<2+>では低親和性で、Ca^<2+>濃度が高くなるに従いIP_3結合活性が上昇し、1μMCa^<2+>以上になると高親和性に達する、EC_<50>が872nMCa^<2+>のシグモイドカーブを示した。いずれのタイプのCa^<2+>依存性の親和性変化は可逆的であった。いくつかの系で、IP_3結合が低親和性の時にIP_3感受性Ca^<2+>チャネル活性が観察され、高親和性に変換するとチャネル活性がなくなることが報告されている。従って、細胞内のCa^<2+>濃度とIP_3濃度の両方がタイプ特異的なIP_3誘導Ca^<2+>放出を巧妙に制御することが予想される。IP_3受容体の膜貫通領域を含むC末端部分とGreen Fluorescent Protein(GFP)とを融合したタンパク質をアフリカツメガエル卵母細胞で発現させた。共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察すると、発現タンパク質は網目状に分布する細胞内膜(小胞体など)に存在し、核膜外膜にも多く存在した。これらは何れもCa^<2+>ストア膜であることからIP_3受容体本来の局在部位に合致する。また、クロスリンク実験で発現タンパク質が四量体を形成することが解った。以上のことから、IP_3受容体の四量体形成とCa^<2+>ストア膜への局在にはチャネル領域を含むC末端部分が重要であることが明らかとなった。

1.在大肠杆菌中表达IP_3受体的IP_3结合区，并在氨基酸水平分析其IP_3配体结合活性。 N端225-578个氨基酸形成IP_3结合的“核心区”，Arg-265、LYs-508和Arg-511被发现是必需的碱性氨基酸。另一方面，研究表明，N 末端的 224 个氨基酸实际上抑制 IP_3 结合。我们使用杆状病毒载体/昆虫细胞系统成功表达了大量具有功能性 IP_3 结合活性的人类 IP_3 受体。表达的IP_3受体的IP_3结合亲和力受Ca^2+影响，1型IP_3受体和3型IP_3受体表现出完全相反的Ca^2+浓度依赖性。 EC_<50>显示，1型在低于10nM的低浓度Ca^2+下具有高亲和力，并且随着Ca^2+浓度的增加，IP_3结合活性逐渐降低，在几μM时达到低亲和力。 100nMCa^<2+>的S形曲线。相反，3型对Ca^2+的亲和力较低，约为100nM或更低，IP_3结合活性随着Ca^2+浓度的增加而增加，对于Ca^2+为1 μMCa^<2+>以上，呈S形曲线，EC_<50>为872nMCa^<2+>，达到高亲和力。两种类型的Ca 2+ 依赖性亲和力变化都是可逆的。据报道，在一些系统中，当IP_3结合为低亲和力时，观察到IP_3敏感的Ca 2+ 通道活性，并且当亲和力转变为高亲和力时，该通道活性消失。因此，预期细胞内Ca 2+ 和IP_3浓度精细地控制类型特异性IP_3诱导的Ca 2+ 释放。在非洲爪蟾卵母细胞中表达含有IP_3受体的跨膜区的C末端部分与绿色荧光蛋白(GFP)融合的蛋白质。使用共焦激光荧光显微镜观察，发现表达的蛋白存在于呈网状分布的细胞内膜（如内质网）中，并且在外核膜中也大量存在。由于这两者都是Ca 2+ 储存膜，因此它们与IP_3受体的原始定位位点相匹配。此外，交联实验表明表达的蛋白质形成四聚体。由上可知，包括通道区域在内的C末端区域对于IP_3受体四聚体的形成和Ca 2+ 储存膜的定位是重要的。