ジーンターゲティングによるPEBP遺伝子ファミリーの機能の解析

基因打靶分析PEBP基因家族的功能

基本信息

批准号：
08264238
负责人：
美野輪治
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Japanese Foundation For Cancer Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヘテロダイマーとして機能する転写因子であるPEBP2/CBFの機能を解析するため、2つのサブユニットをコードするAML1/PEBP2αB(αB)遺伝子、及びPEBP2β/CBFβ(β)遺伝子のノックアウトマウスを作成した。αB遺伝子はDNA結合能を担うruntドメインを標的とし、runtドメインの中央部をコードするエクソン4をネオマイシン耐性遺伝子(neo)に置換した。β遺伝子は転写開始点を含むエクソン1をneoに置換することにより、いわゆるnull変異を導入した。これらのベクターが導入されたES細胞をサザンブロッティング法によりスクリーニーングし、αBで17個、βで1個の相同組換え体のESクローンを得た。これらの細胞からブラストシスト注入法により作成したキメラマウスをライン化し、F2マウスを用いて、その表現型を解析した。αBヘテロ変異体では明らかな異常は認められなかったが、ホモ変異体では血球系の異常が顕著であった。組織学的には胎仔性肝造血が著しく障害されており、コロニーアッセイの結果から、血球細胞のほとんど全ての系列の発達に異常があると考えられた。また興味深いことに、βホモ変異体の表現型もαBホモ変異体とほぼ同一であった。この結果はPEBP2/CBFは胎仔性肝造血に必須な因子であり、その造血の場においてはαBとβがヘテロダイマーとして機能する必要があることが示唆された。今後更に両因子の機能について詳細な解析を行う予定である。我々はさらに、ヒト白血病で高頻度に検出されるAML1/MTG8キメラ遺伝子の機能を知るためにES細胞におけるノックインにより、このキメラ遺伝子を発現させるためのベクターを作成した。このベクターにはloxP配列が組み込まれており、Cre-loxPシステムを利用してマウス血液細胞で時期・系列特異的にキメラ遺伝子を発現させることが可能である。従って、このマウスが樹立されれば、急性白血病発症の分子機序の解明が可能となると思われる。

为了分析PEBP2/CBF的功能，该功能是作为异二聚体起作用的转录因子，为编码两个亚基和PEBP2β/CBFβ（β）基因的AML1/PEBP2αB（αB）基因创建了基因敲除小鼠。 αB基因靶向导致DNA结合能力的Runt结构域，而编码Runt结构域中心部分的外显子4被Neomycin抗药性基因（NEO）取代。 β基因通过替换外显子1的含有转录起源，引入了所谓的无效突变。通过Southern印迹筛选了引入这些载体的ES细胞，以获得17种具有αB和β的同源重组剂的ES克隆。通过这些细胞衬里通过BlastCyST注射方法产生的嵌合小鼠，并使用F2小鼠分析其表型。在αB异源剂中未观察到明显的异常，但同质物在血细胞系统中显示出明显的异常。在组织学上，胎儿造血剂显着受损，菌落测定结果表明，几乎所有血细胞系的发展都有异常。同样有趣的是，β均突变体的表型也几乎与αB均突变体的表型几乎相同。该结果表明，PEBP2/CBF是胎儿肝脏剂的重要因素，并且αB和β必须在造血场中充当异二聚体。将来，我们计划进一步分析这两个因素的功能。我们进一步创建了一个通过在ES细胞中敲入来表达这种嵌合基因的载体，以了解AML1/MTG8嵌合基因的功能，该基因经常在人类白血病中检测到。该载体结合了LOXP序列，并且可以以特定时间的方式表达小鼠血细胞中的嵌合基因。因此，如果建立了这种小鼠，则似乎可以阐明急性白血病发育的分子机制。