ジーンターゲティングによるPEBP遺伝子ファミリーの機能の解析

基因打靶分析PEBP基因家族的功能

• 批准号: 08264238
• 负责人: 美野輪 治
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Japanese Foundation For Cancer Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08264238/
• 关键词: ヒト白血病; PEBP2αB遺伝子; AML1遺伝子; PEBP2β遺伝子; ジーンターゲティング; Cre組換え酵素; LoxP配列; 胎仔性肝造血

ヘテロダイマーとして機能する転写因子であるPEBP2/CBFの機能を解析するため、2つのサブユニットをコードするAML1/PEBP2αB(αB)遺伝子、及びPEBP2β/CBFβ(β)遺伝子のノックアウトマウスを作成した。αB遺伝子はDNA結合能を担うruntドメインを標的とし、runtドメインの中央部をコードするエクソン4をネオマイシン耐性遺伝子(neo)に置換した。β遺伝子は転写開始点を含むエクソン1をneoに置換することにより、いわゆるnull変異を導入した。これらのベクターが導入されたES細胞をサザンブロッティング法によりスクリーニーングし、αBで17個、βで1個の相同組換え体のESクローンを得た。これらの細胞からブラストシスト注入法により作成したキメラマウスをライン化し、F2マウスを用いて、その表現型を解析した。αBヘテロ変異体では明らかな異常は認められなかったが、ホモ変異体では血球系の異常が顕著であった。組織学的には胎仔性肝造血が著しく障害されており、コロニーアッセイの結果から、血球細胞のほとんど全ての系列の発達に異常があると考えられた。また興味深いことに、βホモ変異体の表現型もαBホモ変異体とほぼ同一であった。この結果はPEBP2/CBFは胎仔性肝造血に必須な因子であり、その造血の場においてはαBとβがヘテロダイマーとして機能する必要があることが示唆された。今後更に両因子の機能について詳細な解析を行う予定である。我々はさらに、ヒト白血病で高頻度に検出されるAML1/MTG8キメラ遺伝子の機能を知るためにES細胞におけるノックインにより、このキメラ遺伝子を発現させるためのベクターを作成した。このベクターにはloxP配列が組み込まれており、Cre-loxPシステムを利用してマウス血液細胞で時期・系列特異的にキメラ遺伝子を発現させることが可能である。従って、このマウスが樹立されれば、急性白血病発症の分子機序の解明が可能となると思われる。

为了分析 PEBP2/CBF（一种作为异二聚体发挥作用的转录因子）的功能，我们创建了编码两个亚基的 AML1/PEBP2αB (αB) 基因和 PEBP2β/CBFβ (β) 基因的敲除小鼠。 αB基因针对负责DNA结合能力的runt结构域，编码runt结构域中间部分的外显子4被新霉素抗性基因(neo)取代。通过用 neo 替换包含转录起始位点的外显子 1，将所谓的无效突变引入到 β 基因中。通过Southern印迹法筛选导入这些载体的ES细胞，获得17个αB和1β同源重组ES克隆。通过囊胚注射从这些细胞中产生嵌合小鼠系，并使用 F2 小鼠分析它们的表型。在αB杂合突变体中未观察到明显异常，但在纯合突变体中观察到血细胞系统显着异常。组织学上，胎儿肝脏造血功能明显受损，菌落分析结果表明几乎所有血细胞谱系的发育都存在异常。有趣的是，β纯合突变体的表型也与αB纯合突变体几乎相同。这些结果表明PEBP2/CBF是胎儿肝脏造血的重要因子，并且αB和β需要作为异二聚体在造血领域发挥作用。未来，我们计划对这两个因素的功能进行更详细的分析。此外，为了了解在人类白血病中经常检测到的 AML1/MTG8 嵌合基因的功能，我们创建了一个载体，通过将其敲入 ES 细胞来表达该嵌合基因。该载体包含 loxP 序列，使得使用 Cre-loxP 系统以时间和谱系特异性方式在小鼠血细胞中表达嵌合基因成为可能。因此，如果建立这种小鼠，将有可能阐明急性白血病发病的分子机制。